調節性細胞容積減少によるENaC細胞内局在制御の分子メカニズムの解析

调节细胞减容调控ENaC亚细胞定位的分子机制分析

• 批准号: 15790120
• 负责人: 宮崎 裕明
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790120/
• 关键词: 調節容積減少; 細胞内Cl^-濃度; A6細胞; ENaC; GFP; MQAE; 調節性細胞容積減少; 細胞内Cl濃度

腎臓の遠位尿細管における上皮型Na^+チャネル(ENaC)を介したNa^+の再吸収は、体液量の恒常性維持に重要な働きを有し、血漿浸透圧によって厳密に制御されている。腎尿細管細胞においては、低浸透圧刺激がNa^+再吸収を促進するという報告がなされているが、ENaCの発現やトラフィッキング機構制御による、Na^+再吸収メカニズムはほとんど明らかにされていない。近年、低浸透圧刺激で惹起される調節性容積減少(RVD: Regulatory Vblume Decrease)により、細胞内Cl^-濃度が減少することが、Na^+再吸収の機能亢進に大きく影響している可能性が示唆されている。そこで本研究では、RVD惹起時の細胞内Cl^-濃度減少による、ENaC細胞内トラフィッキングを介した、Na^+再吸収制御機構の解明を目的とした。まず、Cell Analyzer QUANTAをもちいて、RVD惹起時におけるA6細胞の細胞内Cl^-濃度の変化を継時的に測定した。その結果、定常時約60mMでああった細胞内Cl^-濃度は、低浸透圧刺激後に惹起されたRVDによる細胞容積の減少とともに徐々に低下し、30分後には約10mMにまで減少し、細胞内Cl^-濃度の減少が、低浸透圧刺激の細胞内シグナルとして機能していることを明らかにした。また、Xenopus laevisのαENaC遺伝子配列をPCRで増幅した後、pEGFP発現ベクターに組み込み、αENaC+GFPの融合タンパク発現ベクターを作成した。ENaC+GFP発現ベクターを、LIPOFECTAMINE 2000試薬をもちいてA6細胞にtransfectした後、Geneticin耐性細胞をクローン化した。さらに、蛍光顕微鏡観察によりENaC+GFP安定発現株のスクリーニングを行い、ENaC細胞内トラフィッキング解析に用いる細胞株の確立を行った。

Epithelial-type Na^+ accumulation (ENaC) in renal distal urinary tubules is an important factor in Na^+ resorption, maintenance of constant body fluid volume, and control of plasma permeation pressure. Na^+ resorption is promoted by low osmotic pressure stimulation in renal tubule cells. The mechanism of Na^+ resorption in renal tubule cells is controlled by ENAC. In recent years, low osmotic pressure stimulation has caused a decrease in regulatory volume decrease (RVD), a Decrease in intracellular Cl^-concentration, and a large effect on Na^+ reuptake hyperfunction. The aim of this study is to elucidate the mechanism of intracellular Cl^-concentration reduction, Na^+ uptake inhibition and Na^+ uptake inhibition during RVD induction. Cell Analyzer QUANTA and RVD were used to determine the intracellular Cl^-concentration of A6 cells when they were activated. The results showed that the intracellular Cl^-concentration decreased by about 60mM at steady state, the cell volume decreased by about 10mM after low osmotic pressure stimulation, and the intracellular Cl^-concentration decreased by about 10mM after low osmotic pressure stimulation. The αENaC gene sequence of Xenopus laevis was amplified by PCR, and the pEGFP gene sequence and αENaC+GFP gene sequence were constructed. After ENaC+GFP was discovered and LIPOFECTAMINE 2000 test drug was used to transform A6 cells, Geneticin-resistant cells were transformed. ENaC+GFP stable cell lines were identified by microscopy, and ENaC cells were identified by PCR.

项目成果

Aoi, W., Niisato, N., Miyazaki, H., Marunaka, Y.: "Flavonoid-induced reduction of ENaC expression in the kidney of Dahl salt-sensitive hypertensive rat."Biochemical and Biophysical Research Communications. 315. 892-896 (2004)

Aoi, W.、Niisato, N.、Miyazaki, H.、Marunaka, Y.：“类黄酮诱导 Dahl 盐敏感性高血压大鼠肾脏中 ENaC 表达的减少。”生物化学和生物物理研究通讯。