動脈硬化退縮を目指した新しい治療法<ナノテクノロジーを用いた病変指向性NO放出薬と遺伝子治療>の検討

今年度は、遺伝子として(1)テロメア短縮を抑制するTERT(2)エストロゲン受容体α,β等(3)各種NO合成酵素(4)SiRNAを用いたNADPHoxidase遺伝子除去したベクターを用意し,培養血管内皮細胞の検討により効率よく内皮機能を改善し,細胞老化を制御できる組み合わせを検討した。#1 動脈硬化病変選択性遺伝子ウイルスベクター作成:精製済みのeNOS, iNOSのadeno-virus vectorに加え,補酵素BH_4を供給するGTPCHIのベクターを作成し,組み合わせた,NO放出能(酵素活性,NO代謝物,eNOS, iNOSmRNA,蛋白,活性酸素放出能(MLCA, FACScan)等を予定する。#2 SiRNAを用いたNADPHoxidase除去ベクター:NADPH oxidase (p47phox)のSiRNAを作成し,培養内皮細胞に導入時の活性低下を確かめた上で,adenovirus vectorを作成した。siRNAは細胞膜貫通領域での作用遮断を考えp47phoxを選択した。#3 エストロゲン受容体(ER)α,βベクター作成:ERα,βのadnovirus vectorを用いて,eNOS, iNOS及びNADPH oxidase,以下で作るTERTとの相互作用を検討した。エストロゲンと同様ERα,βともeNOSを活性化した。#4 テロメアを延長するTERT等の遺伝子ウイルスベクター:TERTをcloning,精製し,培養細胞(血管壁構成内皮,平滑筋,マクロファージ細胞)に導入し,各種老化指標(各PDLに対するテロメラーゼ活性,βガラクトシダーゼ染色性,P38MAPkinase活性等)及びアポトーシス指標(TUNNEL染色,DNA ladder,各caspase活性等)に対する影響を検討した。

今年度は、遺伝子として(1)テロメア短縮を抑制するTERT(2)エストロゲン受容体α,β等(3)各種NO合成酵素(4)SiRNAを用いたNADPHoxidase遺伝子除去したベクターを用意し,培養血管内皮細胞の検討により効率よく内皮機能を改善し,細胞老化を制御できる組み合わせを検討した。#1 動脈硬化病変選択性遺伝子ウイルスベクター作成:精製済みのeNOS, iNOSのadeno-virus vectorに加え,補酵素BH_4を供給するGTPCHIのベクターを作成し,組み合わせた,NO放出能(酵素活性,NO代謝物,eNOS, iNOSmRNA,蛋白,活性酸素放出能(MLCA, FACScan)等を予定する。#2 SiRNAを用いたNADPHoxidase除去ベクター:NADPH oxidase (p47phox)のSiRNAを作成し,培養内皮細胞に導入時の活性低下を確かめた上で,adenovirus vectorを作成した。siRNAは細胞膜貫通領域での作用遮断を考えp47phoxを選択した。#3 エストロゲン受容体(ER)α,βベクター作成:ERα,βのadnovirus vectorを用いて,eNOS, iNOS及びNADPH oxidase,以下で作るTERTとの相互作用を検討した。エストロゲンと同様ERα,βともeNOSを活性化した。#4 テロメアを延長するTERT等の遺伝子ウイルスベクター:TERTをcloning,精製し,培養細胞(血管壁構成内皮,平滑筋,マクロファージ細胞)に導入し,各種老化指標(各PDLに対するテロメラーゼ活性,βガラクトシダーゼ染色性,P38MAPkinase活性等)及びアポトーシス指標(TUNNEL染色,DNA ladder,各caspase活性等)に対する影響を検討した。