精製ABCAIを用いたコレステロール排出機構の解明

使用纯化的 ABCAI 阐明胆固醇排泄机制

• 批准号: 04J00841
• 负责人: 高橋 圭
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J00841/
• 关键词: ABCA1; Sf9; purification; ATPase; apoA-I; HDL; リン脂質; コレステロール; Apolipoprotein A-I

当研究員はこれまでに昆虫細胞Sf9にヒトABCA1を発現させ精製し、精製ABCA1のATP加水分解活性を人工リポソームに組み込むなど様々な条件下において測定することにより機能解析をおこなった。生化学的アプローチの結果から、ホスファチジルコリンとコレステロールがABCA1の輸送基質となるモデルを提唱した。この研究の経緯から、ヒト膜タンパク質を精製しその機能をさらに詳細に解析するためには、哺乳類由来培養細胞を用いることが有利であると考え、胎児腎臓由来293F-FreeStyle細胞を用いてABCタンパク質を大量に発現させる系を構築した。293F-FreeStyle細胞で安定に発現させたABCA1はSf9を用いたときより高い効率で可溶化された。また、293F-FreeStyle細胞に安定発現させたABCA3は、肺胞II型細胞に発現した内在性ABCA3と同様にリソソームでプロセッシングを受け、高い効率で膜から可溶化された。続けて、ABCA3のプロセッシングによる成熟化についてより詳細に解析した。ABCA3安定発現293F-FreeStyle細胞で非代謝型のグルコースを用いてオートファゴリソソームを誘導すると成熟型ABCA3が増加した。またリソソームのpH低下を解消する試薬であるクロロキンで処理すると成熟型ABCA3が顕著に低下した。さらに、ABCA3の発現によって細胞内のpHが有意に低下することが、蛍光顕微鏡を用いた解析によって明らかとなった。成熟型ABCA3は、前駆体ABCA3とともにヒスチジンタグと陰イオン交換カラムのDE52を用いて高収率で精製することができ、精製ABCA3は、ATP加水分解活性を示した。以上のことより、膜タンパク質の発現-精製系として293F-FreeStyleが有効であることが明らかとなった。現在ABCA1とABCA3の機能解析を精力的に進めている。

When the researchers studied the ATP hydrolysis activity of ABCA1 in insect cells Sf9, they determined the function of ABCA1 under artificial conditions. The results of biochemical analysis show that ABCA 1 can be used as a transport matrix. This research focuses on the detailed analysis of the functions of cell culture, cell membrane purification and cell culture in mammalian origin, and the construction of a system for the development of cell culture in large quantities using 293F-FreeStyle cells. 293 F-FreeStyle cells are stable and soluble. 293 F-FreeStyle cells develop stability ABCA3 and lung type II cells develop intrinsic ABCA3 and similar soft tissue solutions with high efficiency and membrane solubilization. ABCA 3 is a mature and detailed analysis system. ABCA3 stable development 293F-FreeStyle cells are used to induce the growth of mature ABCA3 The pH of the solution is low, and the mature ABCA 3 is low. The expression of ABCA3 in cells is intentionally low, and the expression of ABCA3 in cells is analyzed by microscopy. Mature ABCA3, precursor ABCA3 and DE52 were purified with high yield and ATP hydrolysis activity. F-FreeStyle is the best way to improve the quality of the film. Now ABCA 1 and ABCA 3 function analysis and energy into the process.

项目成果

脂質輸送とABCタンパク質

脂质转运和 ABC 蛋白

• 发表时间: 2005
• 期刊: 実験医学 増刊 ダイナミックに新展開する脂質研究 Vol.23 No6
• 作者: Tabei;J.;Shiotsuki;M.;Sanda;F.;Masuda;T.;C.Yoshikawa et al.;Kazuyoshi Kanamori;Kazuyoshi Kanamori;Kazuaki Takami;植田和光 ほか
• 通讯作者: 植田和光 ほか

脂質輸送の分子メカニズム研究の黎明

脂质转运分子机制研究的曙光

• 发表时间: 2004
• 期刊: 化学 59(6)
• 作者: Tabei;J.;Shiotsuki;M.;Sanda;F.;Masuda;T.;C.Yoshikawa et al.;Kazuyoshi Kanamori;Kazuyoshi Kanamori;Kazuaki Takami;植田和光 ほか;高橋 圭 ほか
• 通讯作者: 高橋 圭 ほか