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原核細胞で初めて見出されたアンチザイム様蛋白質分解促進因子の構造と作用機構の解明

阐明首次在原核细胞中发现的抗酶样蛋白水解因子的结构和作用机制

基本信息

批准号：
04J03317
负责人：
山口良弘
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J03317/
关键词：
polyamine antizyme ribosomal protein 26S proteasome ATP-dependent protease proteasome

项目摘要

1.LDCと高い相同性を有するマウスODCで調節因子アンチザイムとの結合に重要な塩基性部位を変異させたLDCはP22と結合せず、P22存在下で分解されなかった。また、活性を有するに量体を形成できなくなった変異体は約2倍以上分解が促進されたことから、P22はLDCの単量体と結合し、その後プロテアーゼによって分解されることが示された。さらに、LDCのC末端アミノ酸残基を欠損した変異酵素を作製したところ、C末端アミノ酸を6残基欠失させると分解はほとんどおこらなかった。現在、分解に必須なアミノ酸残基をさらに詳しく解析した結果、C末端側の特定のアミノ酸残基ではなくアミノ酸鎖長が重要であることが示唆された2.本申請者は、LDCをリガンドとしたアフィニティーカラムを用いて、P22以外にLDCに特異的に結合する25kDaのタンパク質を検出した。25-kDaタンパク質をLDCアフィニティーカラム及び陰イオン交換カラムを用いて精製し、N末端アミノ酸配列を解析した結果、25kDaのバンドは2つの蛋白質(25k-1および25k-2)であることが明らかとなった。そこで、2つの蛋白質を分離する目的で二次元電気泳動を行った結果、2つの蛋白質は分子量及び等電点が非常に類似した蛋白質であることが明らかとなった。二次元電気泳動によりタンパク質を分離しN末端アミノ酸残基を解析した結果、両タンパク質ともにリボソームタンパク質と相同性を有することが示唆された。現在、25k-1および25k-2のN末端アミノ酸配列の情報をもとにプローブを作成し、25k-1および25k-2の遺伝子のクローニングを行っている。3.LDC分解に関与するプロテアーゼの特性を解明するために、同定した分解促進因子の存在下で^<35>Sで標識したLDCを分解する活性を指標としたLDC分解系を構築した。基質には二量体を形成できない変異LDCを使用することで従来の方法よりもより短時間でプロテアーゼ活性を検出することができた。現在、構築した系を用いてさらに精製を進めている。

1. It is important that LDC has high homogeneity and ODC has a regulatory factor and that the combination of them is very important. The base part is different and the LDC is the same as P22, and the binding is the same, and the decomposition in the presence of P22 is the same.また、Activity をThere is するにquantity をFormation できなくなった変different body はAbout 2 times more decomposition がPromote されたことから, P22はLDCのunitary bodyとcombinationし、その后プロテアーゼによってDecompositionされることが Showされた.さらに、LDCのC-terminal アミノ acid residue is missing and the した変isozyme is produced by したところ, C-terminal アミノ acid を6 residue is missing due to させると decomposition and はほとんどおこらなかった. Now, the analysis results of the necessary なアミノ acid residues for decomposition and detailed analysis of the C-terminal side Specific のアミノ acid residues ではなくアミノ acid lock length is important であることがshows された 2 .The applicant of this application is は、LDCをリガンドとしたアフィニティーカラムを用いて, P It is a specific combination of LDC other than 22 and a 25kDa のタンパクquality を検出した. 25-kDa タンパクLDC アフィニティーカラム and yin イオン exchange カラムを purified with いて, N-terminal アミノ acid arrayをAnalysis results, 25kDa のバンドは2つのprotein (25k-1および25k-2) であることが明らかとなった.そこで、2つのprotein separationするpurposeでtwo-dimensional electrophoresis を行った results、2つのEG The molecular weight and isoelectric point of white matter are very similar to those of proteins. The results of the separation and analysis of the N-terminal amino acid residue by two-dimensional electrophoresis using electrophoresis,両タンパク性ともにリボソームタンパク性と Sameness を有することが说唆された. Now, 25k-1および25k-2のN-terminal アミノacid alignment information をもとにプローブを成し、25k-1および25k-2の伝子のクローニングを行っている. 3. LDC decomposition is related to the characteristics of LDC decomposition and the existence of the same decomposition promotion factor. Below is the indicator of the decomposition and activity of LDC and the construction of the LDC decomposition system. The matrix and the two-dimensional body are formed and the different LDC is used. Method: short-term active を検出することができた. Now, the construction of the system is done with the use of refined materials.