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原核細胞で初めて見出されたアンチザイム様蛋白質分解促進因子の構造と作用機構の解明

阐明首次在原核细胞中发现的抗酶样蛋白水解因子的结构和作用机制

基本信息

批准号：
04J03317
负责人：
山口良弘
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J03317/
关键词：
polyamine antizyme ribosomal protein 26S proteasome ATP-dependent protease proteasome

项目摘要

1.LDCと高い相同性を有するマウスODCで調節因子アンチザイムとの結合に重要な塩基性部位を変異させたLDCはP22と結合せず、P22存在下で分解されなかった。また、活性を有するに量体を形成できなくなった変異体は約2倍以上分解が促進されたことから、P22はLDCの単量体と結合し、その後プロテアーゼによって分解されることが示された。さらに、LDCのC末端アミノ酸残基を欠損した変異酵素を作製したところ、C末端アミノ酸を6残基欠失させると分解はほとんどおこらなかった。現在、分解に必須なアミノ酸残基をさらに詳しく解析した結果、C末端側の特定のアミノ酸残基ではなくアミノ酸鎖長が重要であることが示唆された2.本申請者は、LDCをリガンドとしたアフィニティーカラムを用いて、P22以外にLDCに特異的に結合する25kDaのタンパク質を検出した。25-kDaタンパク質をLDCアフィニティーカラム及び陰イオン交換カラムを用いて精製し、N末端アミノ酸配列を解析した結果、25kDaのバンドは2つの蛋白質(25k-1および25k-2)であることが明らかとなった。そこで、2つの蛋白質を分離する目的で二次元電気泳動を行った結果、2つの蛋白質は分子量及び等電点が非常に類似した蛋白質であることが明らかとなった。二次元電気泳動によりタンパク質を分離しN末端アミノ酸残基を解析した結果、両タンパク質ともにリボソームタンパク質と相同性を有することが示唆された。現在、25k-1および25k-2のN末端アミノ酸配列の情報をもとにプローブを作成し、25k-1および25k-2の遺伝子のクローニングを行っている。3.LDC分解に関与するプロテアーゼの特性を解明するために、同定した分解促進因子の存在下で^<35>Sで標識したLDCを分解する活性を指標としたLDC分解系を構築した。基質には二量体を形成できない変異LDCを使用することで従来の方法よりもより短時間でプロテアーゼ活性を検出することができた。現在、構築した系を用いてさらに精製を進めている。

1. LDC P22 and ODC are different from each other in the presence of ODC and ODC. For example, if the amount of P22 is increased, the amount of P22 is decreased. In addition, the conversion enzyme of LDC's C-terminal amino acid residue is deficient, and the decomposition of LDC's C-terminal amino acid residue is deficient. 2. The present applicant has demonstrated the importance of the specific acid residues on the C-terminal side in the analysis of the acid residues required for decomposition. 2. The specific acid residues on the LDC side other than P22 are also shown in the analysis of the 25kDa acid residues. The 25-kDa protein was purified and the N-terminal amino acid sequence was analyzed. The 25-kDa protein (25 k-1 k-2 k-2-k-2 Therefore, the purpose of separating 2's proteins is to perform quadratic electromigration. As a result, 2's proteins are very similar in molecular weight and isoelectric point. Two-dimensional electrokinetic analysis of the N-terminal amino acid residues in the molecular mass of the molecule shows that the molecular mass of the molecule is identical to that of the molecule. Now, the 25 k-1 and 25k-2 N-terminal amino acid alignment information should be prepared, and the 25 k-1 and 25k-2 amino acid alignment information should be prepared. 3. <35>The relationship between LDC decomposition and its activity is discussed. The matrix is made of two different materials. Now, the construction of the system is in progress.