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結晶構造解析と蛋白質工学による好アルカリ性アミラーゼ系酵素の活性発現機構の解明

通过晶体结构分析和蛋白质工程阐明嗜碱淀粉酶的活性表达机制

基本信息

批准号：
04J12015
负责人：
金井隆太
金额：
$ 1.47万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

広範囲なpH領域(5.5-11)で活性を示すシクロデキストリン合成酵素(CGTase)について、pH依存性の変化を示す変異型酵素R227Q-,K232Q-,H327N-,D371N-,R375Q-CGTaseの単独構造、阻害剤アカボース複合体の結晶構造をそれぞれ決定した。このうち、R227Q-,H327N-CGTaseでは、触媒残基側鎖の配向が変化しており、本酵素においてArg227,His327は触媒残基構造を形成することに直接関わり、その構造が広範囲なpH領域での活性維持に重要であることが推定された。そのほかの変異型酵素では触媒残基自体の構造は野生型に比べて変化していなかったことから、Lys232,Asp371,Arg375は触媒残基の構造形成に関わっていないが、静電的に触媒残基のプロトンの解離/結合状態に影響している、と考えられた。好アルカリ性マルトヘキサオース(G6)生成アミラーゼについて、そのG6複合体とG5複合体の結晶構造を決定した。その結果、G6は結合部位サブサイト-7から-2に結合し、G5はサブサイト-6から-2に結合していることが明らかになった。このことは本酵素が他のα-アミラーゼと異なり、そのような非生産的結合によってG6分解が抑制されていることを示唆している。特にサブサイト-6から-4のLys72,Trp140,Asp166が非生産的結合に重要であると推定された。そこで、Trp140をロイシン、チロシンに置換してそれぞれ活性測定を行ったところ、ロイシン変異はマルトヘキサオース生成が大きく減少し、チロシン変異でも、マルトヘキサオース生成が大きく減少し、マルトペンタオース生成が上昇していた。このことは特定のサブサイトでの芳香族アミノ酸のスタック相互作用によって、生成物がコントロールされていることを示している。

The pH domain (5.5-11) of CGTase activity is characterized by pH dependent transformation. The structure of R227Q-, K232Q-, H327N-, D371N-, R375Q-CGTase is determined by the crystal structure of CGTase complex. R227Q-, H327N-CGTase is directly related to the formation of the catalytic residue structure, and its structure is important for the maintenance of activity in the pH domain. The structure of the catalyst residue itself is different from that of the wild type. The structure of the catalyst residue is related to the formation of the structure of the catalyst residue. The dissociation/binding state of the catalyst residue is affected by the electrostatic phenomenon. The crystal structure of G6 complex and G5 complex is determined by the formation of G6 complex and G5 complex. The result is that the G6 is bound to the G6, and the G5 is bound to the G6. This enzyme is responsible for the production of G6, which is inhibited by the enzyme. In particular, it is presumed that Lys72, Trp140, Asp166 are important for non-productive binding. For example, Trp140 can be used to determine the activity of the enzyme. For example, Trp 140 can be used to determine the activity of the enzyme. This is the first time that a chemical has been used in the production of aromatic compounds.