味細胞内情報伝達系におけるCa^<2+>シグナリングとK^+チャンネル機能の生理学的解析

本研究では、味覚受容におけるカルシウムシグナリングの重要性をふまえ、味細胞で発現するカルシウム依存性カリウムチャンネルether-a-go-go(eag)の機能の解析を目的としている。昨年度までは、ドミナント機能を持つ変異チャンネルをツメガエル卵母細胞で発現させ、その機能検定を行った。本年度は、このドミナントネガティブeagチャンネルを用いて、コンディショナルにeagチャンネル機能を阻害するトランスジェニック動物の作製を目指した。まず、これに先立って、解析をより効率的に行うためにトランスジェニック動物としてマウスを用いることが出来るかどうか検討した。味細胞特異的に発現させるためにラットPLCβ2遺伝子の上流領域をコンストラクトに用いるが、これについてはマウスに導入した場合も味細胞特異的に働く。そこで、すでに作成済みの抗ラットeag抗体がマウスにおいても用いることが出来るかどうか確かめるため、ddyマウスの舌乳頭の抗体染色を行った。その結果、マウス有郭乳頭においてもeagの染色が確認されたが、その染色強度はラットに比べて弱く、マウスでトランスジェニック動物を作製した場合には発現量を感度よくモニターする点に問題があることが分かった。したがって、トランスジェニック動物としてはラットを用いるほうがよいと結論した。その一方で、味細胞においてPLCβ2と同一の細胞に発現し、その下流で活性化すると予想されているもうひとつのイオンチャンネルTRPM5と、eagチャンネルをツメガエル卵母細胞に共発現させ、機能の関わりを調べる実験も進めている。最近報告されたTRPM5のノックアウトマウスの結果から、実際の味細胞では複数のイオンチャンネルが協働して情報伝達を担っている可能性が考えられ、トランスジェニック動物を用いた解析において、他のチャンネルとの関わりを考慮していく必要がでてきたからである。

本研究では、味覚受容におけるカルシウムシグナリングの重要性をふまえ、味細胞で発現するカルシウム依存性カリウムチャンネルether-a-go-go(eag)の機能の解析を目的としている。昨年度までは、ドミナント機能を持つ変異チャンネルをツメガエル卵母細胞で発現させ、その機能検定を行った。本年度は、このドミナントネガティブeagチャンネルを用いて、コンディショナルにeagチャンネル機能を阻害するトランスジェニック動物の作製を目指した。まず、これに先立って、解析をより効率的に行うためにトランスジェニック動物としてマウスを用いることが出来るかどうか検討した。味細胞特異的に発現させるためにラットPLCβ2遺伝子の上流領域をコンストラクトに用いるが、これについてはマウスに導入した場合も味細胞特異的に働く。そこで、すでに作成済みの抗ラットeag抗体がマウスにおいても用いることが出来るかどうか確かめるため、ddyマウスの舌乳頭の抗体染色を行った。その結果、マウス有郭乳頭においてもeagの染色が確認されたが、その染色強度はラットに比べて弱く、マウスでトランスジェニック動物を作製した場合には発現量を感度よくモニターする点に問題があることが分かった。したがって、トランスジェニック動物としてはラットを用いるほうがよいと結論した。その一方で、味細胞においてPLCβ2と同一の細胞に発現し、その下流で活性化すると予想されているもうひとつのイオンチャンネルTRPM5と、eagチャンネルをツメガエル卵母細胞に共発現させ、機能の関わりを調べる実験も進めている。最近報告されたTRPM5のノックアウトマウスの結果から、実際の味細胞では複数のイオンチャンネルが協働して情報伝達を担っている可能性が考えられ、トランスジェニック動物を用いた解析において、他のチャンネルとの関わりを考慮していく必要がでてきたからである。