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Srcチロシンキナーゼによる血管平滑筋L型Ca2+チャネル機能の調節機構の解明

阐明Src酪氨酸激酶对血管平滑肌L型Ca2+通道功能的调节机制

基本信息

批准号：
16790139
负责人：
砂川昌範
金额：
$ 2.18万
依托单位：
University of the Ryukyus
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

1) _<α1C-b>-L型Ca^<2+>電流へのβ_3サブユニットの役割遺伝子組換えにて作成したβ_3/pRc-CMVプラスミド(Prof. Franz Hoffmannより提供)をラット胎児培養血管平滑筋細胞株(A7r5)にトランスフェクション後、G418(1mg/mL)処理にて発現陽性細胞を選別し、安定発現細胞(β_3/A7r5,clone A5)を確立した。さらに、比較対照としてβ_<2a>/pcDNA3-CMVを過剰発現した安定発現細胞(β_<2a>/A7r5,clone A4)を確立した。パッチ電極を細胞に吸着させた後、5mM Ba^<2+>をチャージキャリアーとして、膜電位固定法下にL型Ca^<2+>電流(I_<Ca(L)>)の測定を行った。その結果、normal A7r5、β_3/A7r5およびβ_<2a>/A7r5のI_<Ca(L)>の振幅に有意な差は見られなかった。即ち、_<α1C-b>およびβ_3をCOS7細胞に共発現した場合と異なり、内在性にL型Ca^<2+>チャネルを発現している平滑筋細胞にβサブユニットを過剰発現させても、L型Ca^<2+>電流の増加が見られないのが判明した。2) pp60^<src>過剰発現によるL型Ca^<2+>電流への影響ラット大動脈由来培養血管平滑筋細胞(A7r5)に野生型src cDNAを含む発現ベクター(Src(wt)/pUSE amp(-))を導入し、src遺伝子を過剰発現させた。その後、G418(1mg/mL)処理にて遺伝子発現陽性細胞を選択し、安定形質発現細胞を確立した(合計12クローン)。ウエスタンブロット法の結果、Src(wt)/pUSE amp(-)導入クローン細胞群は(-)/pUSE amp(-)導入細胞に比して、約34倍量のpp60^<src>蛋白の発現が確認された。L型カルシウム電流(I_<Ca(L)>)の振幅および電位依存特性を比較した結果、pp60^<src>過剰発現細胞のI_<Ca(L)>の電流密度は約2倍に増加した。しかしながら、I_<Ca(L)>の膜電位依存性活性化・不活性化曲線に有意な変化は見られなかった。したがって、pp60^<src>はL型Ca^<2+>チャネルの電気生理学的特性を変化させることなくI_<Ca(L)>の電流密度を増加させているのが判明した。

1)The β_3/pRc-CMV promoter (courtesy of Prof. Franz Hoffmann) was prepared for the β_3/pRc-CMV promoter subculture of the β_3/pRc-CMV subunit of the α_1C-b>-L-type Ca^<2+> current. After treatment with G418(1mg/mL), positive cells were selected and stable cells (β_3/A7r5,clone A5) were established. In addition, the stable <2a>developing cells (β_<2a>/A7r5,clone A4) were established after β_ /pcDNA3-CMV was detected. The L-type Ca^<2 +> current (I_<Ca(L)>) was measured by membrane potential fixation method after adsorption of 5mM Ba^<2+> on the cell. The amplitude of normal A7r5, β_3/A7r5 β_<2a>/A7r5 and I_<Ca(L)> is intentionally different. In other words, it was found that the β-cell and β-cell currents in smooth muscle cells were increased in different and intrinsic L-type Ca <2 +> cells. 2)pp60^<src>~+~+ After treatment, G418(1mg/mL) was used to select the positive cells and establish the stable cells (12 samples in total). As a result of the Src(wt)/pUSE amp(-)-introduced cell population, approximately 34-fold pp60^protein production was confirmed compared to the Src(wt)/pUSE amp(-)-introduced cells<src>. The amplitude and potential-dependent characteristics of L-type cell currents (I <Ca(L)>) were compared. <src>The current density of I <Ca(L)> in pp60 cells increased by about 2 times. The membrane potential-dependent activation and inactivation curves of Ca(L)> and Ca(L)> were calculated. The <src>electrophysiological characteristics of L-type Ca^<2+> ions were determined by the increase of current density of Ca(L) ions.