マラリア重症化に係わる新規病原因子の探求

本研究年度は、膜結合型ケモカインの一つフラクタルカイン(FKN)に対して熱帯熱マラリア原虫感染赤血球が接着する際に利用する、新規熱帯熱マラリア原虫感染赤血球表面発現蛋白質の同定を試みた。研究方法は、(1)FKN接着熱帯熱マラリア原虫株を確立し、当該原虫株よりcDNAライブラリーを作製し、浮遊細胞株Jurkat株へ遺伝子導入する。その後、作製したcDNA導入細胞株と培養プレート表面にコーティングした組み換えFKN蛋白質(rFKN)との直接接着を観察することで、目的蛋白質をクローニングする。(2)yeast two-hybrid(Y2H)法を利用した蛋白質スクリーニングを行う、の2通りで行った。(1)について、FKN接着株を確立した後、当該原虫株よりcDNAライブラリーを作製した。作製したcDNAライブラリーを2種類の哺乳動物細胞発現ベクターに組み込んだマラリア原虫cDNAライブラリー強制発現ベクターを確立した。これらベクターをFKN受容体の発現がないことを確認した浮遊細胞株Jurkatにリポフェクション法およびエレクトロポレーション法にて遺伝子導入した。当該発現ベクターにはC末端側にGFP遺伝子を組み込んでおり、導入遺伝子産物はGFPとの融合蛋白質として発現される。そこで、導入遺伝子産物の発現はFACScanにて確認した。薬剤選抜後、rFKNとの接着を確認したが、当該細胞株とrFKNとの接着は確認できなかった。現在もスクリーニング継続中である。(2)について、Y2Hにてマラリア原虫cDNAライブラリー産物およびFKNとの相互作用を検討した結果、5個の候補蛋白質が同定された。これらの内、2個の蛋白質は接着関連蛋白質のホモローグであり、3個は未知の蛋白質であることがデータベースとの照合の結果明らかとなった。

本研究年度は、膜結合型ケモカインの一つフラクタルカイン(FKN)に対して熱帯熱マラリア原虫感染赤血球が接着する際に利用する、新規熱帯熱マラリア原虫感染赤血球表面発現蛋白質の同定を試みた。研究方法は、(1)FKN接着熱帯熱マラリア原虫株を確立し、当該原虫株よりcDNAライブラリーを作製し、浮遊細胞株Jurkat株へ遺伝子導入する。その後、作製したcDNA導入細胞株と培養プレート表面にコーティングした組み換えFKN蛋白質(rFKN)との直接接着を観察することで、目的蛋白質をクローニングする。(2)yeast two-hybrid(Y2H)法を利用した蛋白質スクリーニングを行う、の2通りで行った。(1)について、FKN接着株を確立した後、当該原虫株よりcDNAライブラリーを作製した。作製したcDNAライブラリーを2種類の哺乳動物細胞発現ベクターに組み込んだマラリア原虫cDNAライブラリー強制発現ベクターを確立した。これらベクターをFKN受容体の発現がないことを確認した浮遊細胞株Jurkatにリポフェクション法およびエレクトロポレーション法にて遺伝子導入した。当該発現ベクターにはC末端側にGFP遺伝子を組み込んでおり、導入遺伝子産物はGFPとの融合蛋白質として発現される。そこで、導入遺伝子産物の発現はFACScanにて確認した。薬剤選抜後、rFKNとの接着を確認したが、当該細胞株とrFKNとの接着は確認できなかった。現在もスクリーニング継続中である。(2)について、Y2Hにてマラリア原虫cDNAライブラリー産物およびFKNとの相互作用を検討した結果、5個の候補蛋白質が同定された。これらの内、2個の蛋白質は接着関連蛋白質のホモローグであり、3個は未知の蛋白質であることがデータベースとの照合の結果明らかとなった。