天然アミノ糖による培養骨芽細胞の増殖分化促進と石灰化能の亢進に関する研究

天然氨基糖促进培养成骨细胞增殖分化及增强矿化能力的研究

基本信息

批准号：
16791159
负责人：
山田志津香
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度は、微小重力を模擬するためのクリノスタットを用いて、実験的に骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性を低下させた後、天然アミノ糖であるキトサンを培地に添加することでALP活性が改善することを確認した。今年度は、昨年度に用いたキトサン(モノマー)より大きい分子量のキトサン(ポリマー)を培地に添加して、培養骨芽細胞への生物学的石灰化に関する影響をin vitroの実験系で検討した。実験にはNOS-1細胞というヒト骨肉腫由来の骨芽細胞を用いた。まず、キトサンポリマー(分子量:10,000 Da)を酢酸溶液に溶解後、pH7.4に調整して0.2μmフィルターで濾過減菌を行い、キトサン溶液を調整した。そして、ポリマーの至適濃度を調査する為に、a-MEM培地中に総濃度が0.0005%、0.0025%、0.005%、0.05%、0.5%となるようにキトサン溶液を添加して、1×10^6 cells/60mm dishの同細胞を播種し、培養を行った。培養3日目に、細胞を回収し、ALP活性と総蛋白濃度が測定された。その結果、キトサンモノマーでの実験結果と同様に、ポリマーにおいても0.005%キトサン群がコントロール群より有意に高いALP活性を示した(p<0.05)。次に、同細胞を上記と同様の条件で培養した後、石灰化に関連するmRNAの発現を検討する為にリアルタイムPCR装置を用いて解析を行った。その結果、インターフェロンγレセプター(IFNγ receptor)とインテグリンβ1(ITGβ1)の発現が僅かに増加することを確認した。更に、同細胞を有機リン酸塩含有の培地で15日間、培養後、石灰化結節の形成を確認する為に、von-Kossa染色を行った。その結果、キトサン群の石灰化物がコントロール群よりも多く見られた。これまでにモノマーを用いた研究において、今回と同様の石灰化を促進する所見を得ているが、モノマーは主にMAPK経路に関連する遺伝子が増加したのに対し、ポリマーでは細胞接着に関連する遺伝子の発現も僅かに増加していた。本結果から、極低濃度のポリマーにおいても、IFNγ receptorとITGβ1を介して骨芽細胞のALP活性を増加させ石灰化を促進させる可能性が示唆された。以上の研究結果を、2005年6月に北海道で開催された第122回日本歯科保存学会春季大会においてポスター発表した。

去年，我们证实，在实验性降低碱性磷酸酶（ALP）活性后，使用clinostat进行骨细胞中的碱性磷酸酶（ALP）活性，以模仿微重力，通过将天然氨基糖（一种天然氨基糖）添加到培养基中，改善了ALP活性。今年，将分子量大于去年使用的分子量大于壳聚糖（单体）的壳聚糖（聚合物）添加到培养基中，并在体外实验系统中检查了对生物钙化对培养成骨细胞的影响。对于实验，使用了源自人骨肉瘤的NOS-1细胞。首先，将壳聚糖聚合物（分子量：10,000 DA）溶解在乙酸溶液中，然后调节至pH 7.4，并使用0.2μm滤光片通过过滤进行灭菌以准备壳聚糖溶液。为了研究聚合物的最佳浓度，将壳聚糖溶液添加到A-MEM培养基中，以使总浓度为0.0005％，0.0025％，0.005％，0.05％，0.05％，0.05％，0.5％，以及1×10^6细胞/60mm菜肴的相同细胞被播种和培养。在培养的第三天，收集细胞并测量ALP活性并测量总蛋白质浓度。结果，类似于壳聚糖单体的实验结果，壳聚糖组的ALP活性也明显高于聚合物中的对照组（P <0.05）。接下来，将细胞在与上述相同的条件下培养，然后使用实时PCR装置进行分析，以研究与钙化相关的mRNA的表达。结果，证实了干扰素γ受体（IFNγ受体）和整联蛋白β1（ITGβ1）的表达略有增加。此外，将细胞在含有有机磷酸盐的有机培养基中培养15天，然后进行von-kossa染色以确认形成钙化的结节。结果，观察到壳聚糖组的钙化比对照组中的钙化更多。先前使用单体的研究表明，促进与本研究相似的钙化，但是单体主要增加了与MAPK途径相关的基因，但聚合物也略微增加了与细胞粘附相关的基因的表达。这些结果表明，即使在聚合物浓度极低的情况下，它也可能增加成骨细胞中的ALP活性并通过IFNγ受体和ITGβ1促进钙化。上述研究的结果是在2005年6月在北海道举行的第122届日本牙科保护春季会议上作为海报。