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Na+/H+交換輸送体制御因子CHPの結晶構造の決定とそれに基づく機能解析

Na+/H+交换转运调节剂CHP晶体结构的测定及基于其的功能分析

基本信息

批准号：
05F05637
负责人：
若林繁夫
金额：
$ 1.54万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

生体イオン環境の制御を担うトランスポータNa^+/M^+交換輸送体(NHE、SLC9ファミリー)は、心疾患や癌の病態の進行にも深く関わることが知られている。私たちは最近、NHEに強固に結合するカルシニュリン様蛋白質、CHP(CHP1およびCHP2)がNHEの活性とその制御に必須であること、またその第二アイソフォームCHP2が癌細胞の速い増殖に関与することを発見した。本研究は、これらのCHPとNHEとの複合体の結晶構造解析を行い、1)CHPがどのような分子基盤でNHEに特異的に結合するのか?2)CHP結合がどのようにNHEの輸送活性を調節するのか?を明らかにする研究をめざした。そのためにまず、CHP2アイソフォームとNHE1側の結合ドメインペプチド(aa503-545)を異なった発現ベクターに導入し、大腸菌から両者の複合体タンパク質を大量に精製する系を作成した。精製タンパク質を用いて結晶化スクリーニングを行い、イットリウム(Y^<3+>)イオン存在下において結晶化する条件を発見し、SPring-8の大型ビームラインを用いて回折データを収集し、2.7Åで構造を解いた(EMBO J)。その結果、CHP2には中央に大きな疎水性に富んだ溝があり、そこにNHE1のCHP結合領域を形成するαヘリックスが疎水性残基の面を向けてみごとに収まっていることが見出された。CHP2は全体で55x47x28Åのサイズを持ち、12個のαヘリックスと4個のβシートを含み、N-lobeとC-lobeの二つの大きなドメインからなる。CHP2にはN-およびC-lobeをつなぐ比較的長いリンカー領域がタンパク質の外に突き出すような構造が存在する。こうした構造は同属の他のタンパク質には存在せず、私たちはCHP-unique (CU) regionと呼んでいる。機能解析により、この領域はNHE1の活性調節に重要であることがわかった。

The control of biological environment is very important for Na^+/M^+ exchange transporter (NHE, SLC9), heart disease and cancer. NHE strong binding protein, CHP(CHP1) and CHP2 are essential for the control of NHE activity. In this study, the crystal structure analysis of CHP and NHE complexes was carried out. 1)CHP and NHE complexes were specifically bound to CHP molecular substrates. 2)CHP binding and NHE transport activity regulation A study of the relationship between the two countries The system for purification of large quantities of the complex of the introduction of Escherichia coli and the production of the complex of Escherichia coli was prepared by the combination of CHP2 and NHE1 (aa503-545). The crystallization conditions for the purification of the crystal mass in the presence of Y^<3+> were found, and the structure of SPring-8 was resolved by using the reverse analysis method (EMBO J). The results of CHP2 are as follows: CHP2 is 55x47x28 CHP2 is a N-lobe, C-lobe, and C-lobe. The structure belongs to the CHP-unique (CU) region. Function analysis, domain and activity regulation of NHE1 are important.