放射線照射後におけるクロマチン構造変化の解析

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クロマチン構造変化に関連する研究対象として、シュゴシン-PP2A複合体がセントロメアの染色体接着を守る機構の解析を行った。シュゴシンSgoは真核生物に広く保存されたタンパク質である。ヒトの細胞では、分裂前期に染色体が凝集するのに伴い、コヒーシンがPolo-like kinase(Plk1)によりリン酸化されることにより染色体腕部から解離するが、セントロメアのコヒーシンは分裂中期まで守られる。この素過程において、ヒトシュゴシンhSgo1およびhSgo2はセントロメアに局在してセントロメアのコヒーシンを守っていると推測されるが、その分子機構については未だ不明であった。本研究では、HeLa細胞でヒトのシュゴシンhSgo1およびhSgo2と共沈するタンパク質の解析により、hSgo1およびhSgo2がプロテインフォスファターゼPP2Aと複合体を形成していることが明らかとなった。実際、HeLa細胞から精製したhSgo複合体が、コヒーシンサブユニットのSA1およびSA2よりリン酸を脱離する活性を持っことがin vitroの実験で示された。またin vivoの実験から、間期から分裂期への移行に伴ってSA2の大部分はリン酸化されると同時にクロマチンから解離するが、セントロメアにわずかに残されたSA2は脱リン酸化されていることが判明した。これらの事実は、セントロメアでPP2Aと複合体を形成したシュゴシンがPlk1によるコヒーシンのリン酸化を防ぐことによって、分裂中期までコヒーシンの解離を防いでいることを強く示唆している。さらにそれまでの研究を発展させるため、マウス精巣組織を用いて減数分裂期の細胞のセントロメアクロマチン構造の解析に着手した。ここではセントロメアクロマチン構成因子であるCENP-C蛋白質に会合する因子の網羅的同定を行い、何が体細胞分裂期と減数分裂期のクロマチン構造に機能的な差異を与えているのかを解明しようと試みた。具体的にはマウス精巣の減数分裂期細胞から分離したクロマチン画分よりセントロメアタンパク質CENP-Cに対する抗体を用いたaffinity精製により減数分裂期セントロメアタンパク複合体の同定をおこなった。LC-MS/MS解析の結果、(1)既知のキネトコア構成タンパク質群(CENPs、Mis12複合体、スピンドルチェックポイントタンパク質)に加えて、(2)PIWIをはじめとする生殖細胞内でsmall nuclearRNAのプロセシングに関与すると推測される多数のタンパク質群が含まれていることが判明した。さらに上記(1)(2)のいずれのクラスにも分類されない生殖細胞特異的に発現する新規のタンパク質について焦点を絞って解析を行った。生殖細胞特異的に発現するRing-Zn fngerタイプの新規タンパク質は減数分裂期のPachytene期以降に強く発現し、相同染色体の脱対合の時期にSynaptnemal complexと部分的に共局在することが判明した。このことはSynaptnemal complexの脱離過程で、このRing-Zn finger型タンパク質がなんらかの機能を演じていることを示唆するものである。現在この新規タンパク質のノックアウトマウスを作製し、減数分裂期の染色体分離に与える影響を解析しようと試みている。