ラット脳幹孤束核における神経伝達物質放出制御機構の解明

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本年度は、昨年度確立したin-vivo神経節遺伝子ノックダウンによるシナプス伝達の影響を解析した。スライス標本を用いた伝達物質放出の定量的解析アデノシンA_1受容体のmRNAに対する合成siRNA(siRNA^<A1R>)の節状神経節導入1-15日後、節状神経節を摘出し、RNAを抽出し、定量RT-PCR法によりmRNA発現量を定量した。A_1受容体のmRNAの対GAPDH発現率は導入3-7日で30%以下まで低下した。シナプス伝達に及ぼすA_1受容体遺伝子ノックダウンの影響を評価するため、節状神経節を摘出した個体から脳幹スライス標本を作成し、脳スライス標本を用いて、1次求心線維刺激誘発興奮性シナプス後電流(eEPSC)の振幅に及ぼすアデノシン(100μM)の影響を検討した。siRNA導入10日後までは、アデノシンは、無処置群と同程度(抑制率、41.1±7.3%)かつ同様の時間経過でeEPSC振幅を抑制した。導入11日後、この抑制率は16.3±3.4%まで有意に減弱した。アデノシンのeEPSC振幅抑制効果のsiRNAによる減弱は導入後13日まで持続した。どの遺伝子も標的としないように配列されたランダムsiRNA(siRNA^<RND>)およびvehicleとして用いたPBSの導入はアデノシンによるeEPSC振幅抑制に影響しなかった。誘発EPSCの各パラメータ(振幅、rise time、decay tau)には、siRNA^<A1R>導入群、siRNA^<RND>導入群、PBS導入群および無処置群(日齢一致)の間に有意な差はなかった。以上の実験成果から、脳に投射する神経細胞にRNAiを用いた遺伝子ノックダウン法を適用することにより、脳幹孤束核シナプスにおける特定の遺伝子の機能的ノックダウンが可能であることが実証された。以上の成果をまとめ、近日中に神経科学専門誌に投稿する予定である。