シヌクレイノパチーにおけるα-シヌクレインのユビキチン化の意義の解明

阐明 α-突触核蛋白泛素化在突触核蛋白病中的意义

• 批准号: 16700313
• 负责人: 野中 隆
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16700313/
• 关键词: αシヌクレイン; ユビキチン; 線維; 神経変性疾患; パーキンソン病

昨年度までに決定した可溶性αシヌクレインのin vitroユビキチン化部位(Lys21,Lys23,Lys32,Lys34)およびαシヌクレイン線維のユビキチン化部位(Lys6,Lys10,Lys12)が,実際にin vivoでもユビキチン化されているかどうかについて検討した。293T細胞を用いて,タグなしαシヌクレインおよびHA-ユビキチンをコードする発現ベクターを共発現させ,そのライセートを抗αシヌクレイン抗体あるいは抗ユビキチン抗体を用いてイムノブロット解析した。その結果,αシヌクレインとHA-ユビキチンを共発現させた場合にのみ,両抗体で認識される分子量約22kのバンドが検出でき,細胞内でαシヌクレインがユビキチン化できることが示された。αシヌクレインのN末端側に存在する繰り返し配列中のLysをArgに置換した変異体を発現させたところ,Lys6,Lys10,Lys12の3ヵ所をArgに置換した変異体を発現させた場合に顕著なユビキチン化の抑制が認められた。以上の結果より,293T細胞内でのαシヌクレインの主要なユビキチン化部位はLys6,Lys10,Lys12であることが判明した。この部位はαシヌクレイン線維のin vitroユビキチン化部位と同じ位置であった。したがって,293T細胞にαシヌクレインを大量に発現させると,一部の分子に何らかのコンフォーメーション変化などによる異常(線維化もしくはオリゴマー形成など)が生じ,ユビキチン化されるという機構が示唆された(Nonaka etal, Biochemistry,44,361-368,2005)。以上の機構は実際の患者脳におけるαシヌクレインのユビキチン化の機構を反映している可能性があるため,次にαシヌクレイノパチー患者脳におけるαシヌクレインのユビキチン化部位の同定を行った。αシヌクレイノパチーの一種であるHallervorden-Spatz病患者脳より調製したユビキチン化αシヌクレインを含む画分をリジルエンドペプチダーゼで消化し,nanoflow LC-MS/MSで解析した。その結果,予備的ではあるがLys12がユビキチン化部位の一つであることが判明した。すなわち,実際の患者脳に存在するユビキチン化αシヌクレインのユビキチン化部位は,上述した培養細胞内でのユビキチン化部位とほぼ同じであることが明らかとなった。したがって,シヌクレイノパチー患者脳におけるαシヌクレインのユビキチン化はその蓄積・線維化に必須な(原因となる)現象でなく,細胞内で不溶化・蓄積したαシヌクレインをユビキチン・プロテアソーム系で除去しようと試みた結果の現象であることが示唆された。

Yesterday's annual ま で に decided し た soluble alpha シ ヌ ク レ イ ン の in vitro ユ ビ キ チ ン change parts (Lys21 Lys23, Lys32, Lys34) お よ び alpha シ ヌ ク レ イ ン line d の ユ ビ キ チ ン change parts (Lys6 Lys10, Lys12) が, be interstate に in vivoで ユビキチ ユビキチ equalization されて る る <s:1> う に に て検 て検 て検 to claim た. 293 t cells を using い て, タ グ な し alpha シ ヌ ク レ イ ン お よ び HA - ユ ビ キ チ ン を コ ー ド す る 発 now ベ ク タ ー を 発 now total さ せ, そ の ラ イ セ ー ト を resistant alpha シ ヌ ク レ イ ン antibody あ る い は resistance ユ ビ キ チ ン antibody を with い て イ ム ノ ブ ロ ッ ト parsing し た. そ の results, alpha シ ヌ ク レ イ ン と HA - ユ ビ キ チ ン を 発 now total さ せ た occasions に の み, struck the antibody で know さ れ る molecular weight about 22 k の バ ン ド が 検 out で き, intracellular で alpha シ ヌ ク レ イ ン が ユ ビ キ チ ン change で き る こ と が shown さ れ た. Alpha シ ヌ ク レ イ ン の N terminal side に exist す る Qiao り return し match column の Lys を Arg に replacement し た - variant を 発 now さ せ た と こ ろ, Lys6, Lys10, Lys12 の 3 ヵ を Arg に replacement し た - variant を 発 now さ せ た occasions に 顕 the な ユ ビ キ チ ン change の inhibit が recognize め ら れ た. Results above の よ り, 293 t cells で の alpha シ ヌ ク レ イ ン の main な ユ ビ キ チ ン change parts は Lys6, Lys10, Lys12 で あ る こ と が.at し た. The <s:1> <s:1> site <s:1> αシヌ レ レ レ <s:1> linear dimension <s:1> in vitroユビキチ the immunized site と and じ position であった. し た が っ て, 293 t cells に alpha シ ヌ ク レ イ ン を large に 発 now さ せ る と, what a molecular に の ら か の コ ン フ ォ ー メ ー シ ョ ン variations change な ど に よ る anomalies (line d も し く は オ リ ゴ マ ー form な ど) が じ, ユ ビ キ チ ン change さ れ る と い う institutions が in stopping さ れ た (Nonaka etal, Biochemistry,44,361-368,2005. の agencies above は be interstate の patients 脳 に お け る alpha シ ヌ ク レ イ ン の ユ ビ キ チ ン change の institutions を reflect し て い る possibility が あ る た め, time に alpha シ ヌ ク レ イ ノ パ チ ー patients 脳 に お け る alpha シ ヌ ク レ イ ン の ユ ビ キ チ の ン change parts with fixed line を っ た. Alpha シ ヌ ク レ イ ノ パ チ ー の a で あ る Hallervorden Spatz disease - 脳 よ り modulation し た ユ ビ キ チ ン the alpha シ ヌ ク レ イ ン を containing む draw points を リ ジ ル エ ン ド ペ プ チ ダ ー ゼ で digest し, nanoflow LC - MS/MS analytical し で た. Youdaoplaceholder0 そ as a result, the prepared で である が あるが llys12 がユビキチ agularized site <s:1> である とが とが とが was determined to be た. す な わ ち, be actually の patients 脳 に exist す る ユ ビ キ チ ン the alpha シ ヌ ク レ イ ン の ユ ビ キ チ ン parts は, the し た culture cells で の ユ ビ キ チ ン change parts と ほ ぼ with じ で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. し た が っ て, シ ヌ ク レ イ ノ パ チ ー patients 脳 に お け る alpha シ ヌ ク レ イ ン の ユ ビ キ チ ン change は そ の accumulation, line dimensions に must な (reason と な る) phenomenon で な く, the accumulation of intracellular で don't melt, し た alpha シ ヌ ク レ イ ン を ユ ビ キ チ ン · プ ロ テ ア ソ ー で ム department to remove し よ う と try み た results の phenomenon で あ る こ と が business さ Youdaoplaceholder0.

项目成果

Cleavage of nonmuscle myosin heavy chain-A during apoptosis in human Jurkat T cells.

人 Jurkat T 细胞凋亡过程中非肌肉肌球蛋白重链 A 的裂解。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Journal of Biochemistry (Tokyo)
• 作者: Masahiko Kato;H. Fukuda;T. Nonaka;S. Imajoh‐ohmi
• 通讯作者: S. Imajoh‐ohmi

Cleavage of the carboxyl-terminus of Ku80 during apoptosis in human Jurkat T cells.

人 Jurkat T 细胞凋亡过程中 Ku80 羧基末端的裂解。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Journal of Biochemistry (Tokyo) 137
• 作者: Kajiwara R.;Tominaga T.;Takashima I.;Nonaka T. et al.;Kato M.et al.
• 通讯作者: Kato M.et al.

Ubiquitination of alpha-synuclein.

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry
• 影响因子: 2.9
• 作者: T. Nonaka;T. Iwatsubo;M. Hasegawa

Frontotemporal dementia with Pick-type histology associated with Q336R mutation in the tau gene.

具有 Pick 型组织学特征的额颞叶痴呆与 tau 基因 Q336R 突变相关。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Brain 127
• 作者: Pickering-Brown;S.M.;et al.
• 通讯作者: et al.