多面的応用が可能な高感度キナーゼ蛍光アッセイ系の開発

开发具有多方面应用的高灵敏度激酶荧光检测系统

• 批准号: 17790093
• 负责人: 梅澤 直樹
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790093/
• 关键词: キナーゼ; 検出法; 蛍光試薬; スクリーニング; リン酸化; クマリン; プロテインキナーゼA; カゼインキナーゼ

筆者は、リン酸化されたセリンとトレオニンの化学的性質に着目したセリンートレオニンキナーゼの新規蛍光検出法の開発を進めている。具体的には、まず固相に担持した基質ペプチドに、キナーゼを作用させてリン酸化を行い、続く塩基性条件下でのリン酸基のβ脱離により、セリン及びトレオニン残基が炭素-炭素二重結合を有するように誘導化する。この二重結合はマイケル付加を受けやすいため、チオール基等をもつ蛍光性化合物の添加により、リン酸基を有していたセリン或いはトレオニン残基を蛍光性に変換するというものである。既に、固相としてビーズを用いた系で、本検出原理を用いたプロテインキナーゼA活性、カゼインキナーゼ活生の検出に成功しており、本検出原理の一般性が示されている。さらに、本検出系がキナーゼ阻害剤の評価にも用いうることが明らかとなっている。だが、幾つかの問題点が浮き彫りとなった。本検出法最大の問題点は、基質ペプチドのリン酸化段階にある。現在はビーズに固定化したペプチドを基質としているが、巨大な酵素はビーズ内に浸透できず、基質ペプチドがリン酸化されないことが明らかとなった。そこで、固相としてガラスプレートの使用を計画した。プレートを用いた場合、酵素反応は固相表面で進行し、酵素サイズの影響を受け難いと考えられる。また市販のプレートリーダーを用いることで、大幅な集積化、ハイスループット化が可能になる。ローダミンを蛍光団とする新規蛍光色素10種を設計、合成し、市販のプレートリーダーに適用可能で、本アッセイ系に適用しうる新規蛍光試薬の開発に成功した。ペプチドを担持する固相として、様々なプレートアレイを検討したところ、その表面加工により、非特異的な蛍光の強度が大きく異なることが明らかとなった。現在最適なプレートを探索中である。

The author は, リ ン acidification さ れ た セ リ ン と ト レ オ ニ ン の chemical に the properties of the mesh し た セ リ ン ー ト レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ の new rules 蛍 検 out light method の open 発 を into め て い る. Specific に は, ま ず solid-phase に bear hold し た matrix ペ プ チ ド に, キ ナ ー ゼ を role さ せ て リ ン acidification を い, 続 く salt basic conditions で の リ ン acid radical の beta from に よ り, セ リ ン and び ト レ オ ニ ン residues が carbon - carbon double combined を have す る よ う に induced change す る. こ の double combination は マ イ ケ ル plus を by け や す い た め, チ オ ー ル base such as を も つ 蛍 optical compound の added に よ り, リ ン acid radical を have し て い た セ リ ン or い は ト レ オ ニ ン residues を 蛍 optical に variations in す る と い う も の で あ る. Both に, solid phase と し て ビ ー ズ を with い た で, this principle of 検 out を い た プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ A activity and カ ゼ イ ン キ ナ ー ゼ live birth の 検 に successful し て お り, this general が 検 out principle の さ れ て い る. さ ら に, this 検 out が キ ナ ー ゼ resistance against tonic の review 価 に も with い う る こ と が Ming ら か と な っ て い る. Youdaoplaceholder0, several だが だが problem points が are exaggerated だが となった. The biggest <s:1> problem points of this 検 method are ペプチド and the matrix ペプチド リ <s:1> acidification stage にある. Now は ビ ー ズ に immobilized し た ペ プ チ ド を matrix と し て い る が, huge な enzyme は ビ ー ズ に soak in で き ず, matrix ペ プ チ ド が リ ン acidification さ れ な い こ と が Ming ら か と な っ た. Youdaoplaceholder0 で で, solid-phase と てガラスプレ てガラスプレ ト ト ト を use the を plan た. プ レ ー ト を with い た occasions, enzyme 応 は solid surface で し, enzyme サ イ ズ の を by け difficult い と exam え ら れ る. ま た city vendor の プ レ ー ト リ ー ダ ー を with い る こ と で, sharp な set product, the ハ イ ス ル ー プ ッ ト change が may に な る. ロ ー ダ ミ ン を 蛍 light 団 と す る new rules 蛍 photopigment 10 を し design, synthesis, city vendor の プ レ ー ト リ ー ダ ー に may で, this ア ッ セ イ department に applicable し う る new rules 蛍 light try 薬 の open 発 に successful し た. ペ プ チ ド を bear hold す る solid-phase と し て, others 々 な プ レ ー ト ア レ イ を beg し 検 た と こ ろ, そ の surface processing に よ り, nonspecific な 蛍 の intensity big が き く different な る こ と が Ming ら か と な っ た. Now the most suitable is なプレ なプレ トを exploring である.

项目成果

On-bead fluorescence assay for serine/threonine kinases

• DOI: 10.1021/ol052125k
• 发表时间: 2005-12-08
• 期刊: ORGANIC LETTERS
• 影响因子: 5.2
• 作者: Akita, S;Umezawa, N;Higuchi, T
• 通讯作者: Higuchi, T

チップ上におけるリン酸化の新規な検出法

新型磷酸化芯片上检测方法

• 发表时间: 2005

キナーゼ活性検出法

激酶活性检测方法

• 发表时间: 2004

Design, synthesis, and evaluation of new type of L-amino acids containing pyridine moiety as nitric oxide synthase inhibitor

• DOI: 10.1016/j.bmc.2006.01.020
• 发表时间: 2006-05-15
• 期刊: BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY
• 影响因子: 3.5
• 作者: Ijuin, R;Umezawa, N;Higuchi, T
• 通讯作者: Higuchi, T

Enhanced catalase-like activity of manganese salen complexes in water : effect of three-dimensionally fixed auxiliary

锰萨伦配合物在水中增强的过氧化氢酶活性：三维固定辅助剂的作用

• 发表时间: 2006
• 期刊: Chem.Commun. (47)
• 作者: Y.Watanabe;A.Namba;N.Umezawa;M.Kawahata;K.Yamaguchi;T.Higuchi
• 通讯作者: T.Higuchi