多面的応用が可能な非RI高感度キナーゼアッセイ系の開発

开发具有多方面应用的非 RI 敏感激酶测定系统

• 批准号: 15790072
• 负责人: 梅澤 直樹
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790072/
• 关键词: プロテインキナーゼ; 活性検出法; 蛍光; リン酸化; ペプチド

筆者は安全かつ高い汎用性を有するキナーゼ活性検出法の開発を目指し、リン酸化アミノ酸の化学的性質に着目した新規キナーゼ活性検出法を考案した。標的酵素群として、まずセリンートレオニンキナーゼを選択し、検出法の開発に着手した。筆者の考案したキナーゼ活性検出法の概略を以下に示す。まず、キナーゼの基質ペプチドをビーズやプレートといった固相上に調製する。この固相担持ペプチドにキナーゼを作用させ、基質ペプチドをリン酸化した後、塩基処理すればリン酸基がβ-脱離し、炭素-炭素二重結合が生成すると考えられる。新たに生成した炭素-炭素二重結合は、マイケル付加反応の受容体となるため、チオール基を有する蛍光試薬と反応させれば、リン酸化セリン、トレオニンを蛍光性に誘導化できると考えた。はじめに、新規蛍光試薬のデザイン合成を行った。合成に成功した化合物群の中から、β-脱離後のペプチドと速やかに反応し、反応前に比べ約10倍蛍光強度が上昇する化合物を見いだした。この蛍光変化により、本検出系のS/N比、感度、信頼性の向上が期待できる。また、本化合物は新規化合物であり、キナーゼ活性の検出以外にも利用できる可能性がある。ビーズに担持したペプチドを基質として用い、本検出原理でキナーゼ活性を検出できるか検討した。キナーゼとしてプロテインキナーゼA(PKA)を用いたところ、種々の検討を要したものの、PKA活性を蛍光強度変化として検出可能な条件を見出した。また本検出法を用いたPKA阻害剤のスクリーニングも可能であった。さらに、ほぼ同様の条件でカゼインキナーゼI活性の検出にも成功し、本検出法が一般性を有していることも明らかとなった。今後、マイクロプレートに担持させたペプチドを用いた検討や、脱リン酸化酵素活性の検出など、更なる改良、応用を進めていきたい。

The author は security か つ high い domestic sex を す る キ ナ ー ゼ の activated 検 out process open 発 を refers し, リ ン acidification ア ミ の ノ acid chemical に the properties of the mesh し た new rules キ ナ ー ゼ を activated 検 out process test case し た. Target enzyme of と し て, ま ず セ リ ン ー ト レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ を sentaku し, 検 の open 発 に to し た. The author 's research case たキナ ゼ ゼ active 検 method を outline を the following に shows す. ま ず, キ ナ ー ゼ の matrix ペ プ チ ド を ビ ー ズ や プ レ ー ト と い っ た に on solid phase modulation す る. こ の solid-phase bear hold ペ プ チ ド に キ ナ ー ゼ を role さ せ, matrix ペ プ チ ド を リ ン acidification し た after, salt base 処 す れ ば リ ン acid radical が beta from し, carbon - carbon double combination が generated す る と exam え ら れ る. New た に generated し た carbon - carbon double は, マ イ ケ ル plus the 応 の by let body と な る た め, チ オ ー ル を has an す る 蛍 light try 薬 と anti 応 さ せ れ ば, リ ン acidification セ リ ン, ト レ オ ニ ン を 蛍 optical に induced change で き る と exam え た. Youdaoplaceholder0, new regulation 蛍 photodrug test <s:1> デザ <s:1> <s:1> synthesis を line った. Synthetic に successful し た compound group of の か ら, after the beta from の ペ プ チ ド と speed や か に anti 応 し, about 10 times than the former 応 に べ 蛍 light intensity が rise す る compound を see い だ し た. The <s:1> <s:1> 蛍 light variation によ, the original 検 out-series <s:1> S/N ratio, sensitivity, and reliability <s:1> are expected to increase が and で る る る. ま た, this compound は new rules compound で あ り, キ ナ ー ゼ active の 検 out outside に も using で き る possibility が あ る. ビ ー ズ に bear hold し た ペ プ チ ド を matrix と し て in い, this 検 principle で キ ナ ー ゼ active を 検 out で き る か beg し 検 た. キ ナ ー ゼ と し て プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ A (PKA) を い た と こ ろ, kind of 々 の beg を 検 to し た も の の, PKA activity を 蛍 light intensity variations change と し て 検 を な conditions show the potential し た. ま た this 検 out method を い た PKA resistance against tonic の ス ク リ ー ニ ン グ も may で あ っ た. With others in さ ら に, ほ ぼ の conditions で カ ゼ イ ン キ ナ ー ゼ I active の 検 out に も し success, this 検 が general を have し て い る こ と も Ming ら か と な っ た. In the future, マ イ ク ロ プ レ ー ト に bear hold さ せ た ペ プ チ ド を with い た 検 please や, リ ン acidification enzyme activity の 検 out な ど, more な る improvement, 応 を into め て い き た い.

项目成果

キナーゼ活性検出法

激酶活性检测方法

• 发表时间: 2004