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組換え蛍光標識法による天疱瘡抗原のバイオイメージング法の開発

重组荧光标记法开发天疱疮抗原生物成像方法

基本信息

批准号：
17790782
负责人：
藤本篤嗣
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、表皮角化細胞間接着に重要なデスモソームの構成蛋白であるデスモグレイン(Dsg)3、ならびにデスモソームを裏打ちする中間径線維の一つであるケラチン14(K14)に、それぞれ蛍光蛋白質を融合した発現ベクターを複数作成した。そして作成した発現ベクターを培養角化細胞株に遺伝子導入して、発現蛋白の細胞内における局在を観察した。角化細胞に対する遺伝子導入効率に優れたK5プロモータの下流に、マウスDsg3全長およびGFPのcDNAをタンデムに挿入した発現ベクターを作成した。作成した発現ベクターをPam212培養マウス角化細胞株に遺伝子導入したところ、Dsg3-GFP融合蛋白が角化細胞同士の接着面において点状に発現する像が認められた。またK5プロモータの下流に、DsRedおよびhuman K14のcDNAを挿入した発現ベクターを作成してPam212細胞に遺伝子導入したところ、DsRed-hK14融合蛋白が細胞質において網状の構築を示した。さらにDsg3-GFPおよびDsRed-hK14の発現ベクターをPam212細胞にco-transfectionしたところ、同一細胞において膜表面に発現したDsg3-GFPが、DsRed-hK14により裏打ちされる像が観察された。以上の結果より、今回作成したcDNAは、培養生細胞におけるデスモソーム関連蛋白の細胞内局在の経時的変化を解析する上で有用なツールとなると考えられた。今後は作成したcDNAを用いて、アデノウイルス発現系を用いた蛍光融合蛋白の培養角化細胞における発現解析、ならびにmDsg3-GFPならびにDsRed-hK14を表皮基底細胞に発現したdouble transgenic mouseの作成を試みる予定である。

This year, the composition of protein, which is important for the adhesion between epidermal keratinocytes, is composed of a number of proteins (Dsg)3, 14(K14) and 14, which are important for the fusion of light proteins. The development of keratinized cell lines in culture, gene introduction, protein production and intracellular development are under investigation. The gene expression of keratinized cells was optimized for K5 protein expression in the downstream, Dsg3 full-length and GFP cDNA expression in the downstream. To prepare the protein for expression in Pam212 culture medium, Dsg3-GFP fusion protein was introduced into the keratinized cell line and detected in spots on the surface of keratinized cell line. The cDNA of DsRed and human K14 was introduced into Pam212 cells and the expression of DsRed-hK14 fusion protein in the cytoplasm was demonstrated. Dsg3-GFP and DsRed-hK14 were detected in Pam212 cells by co-transfection and on the membrane surface of the same cell. The above results are useful for analyzing the intracellular changes of cDNAs in cultured cells. In the future, we will try to create a double transgenic mouse for the development of human epidermal basal cells by analyzing the development of photofusion proteins in cultured keratinocytes and mDsg3-GFP.