Gjb2コンディショナル・ノックアウトマウスの遺伝子導入による内耳の再生への挑戦

Gjb2条件性敲除小鼠基因转移对内耳再生的挑战

• 批准号: 17791202
• 负责人: 小笠原 香織
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791202/
• 关键词: Gjb2; ノックアウトマウス; コルチ器; アポトーシス

GJB2は1997年に発見された遺伝子で、ギャップジャンクション蛋白であるコネキシン26(CX26)をコードする遺伝子であり、難聴遺伝子の中で最も変異の頻度が高い遺伝子として注目を集めている。その動物モデルとしてgjb2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、その生理学的・形態学的解析を行った。Cre recombinase 存在下でgjb2遺伝子翻訳領域が切り取られるようにコンストラクトを作成した。ターゲッティングベクターはネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、二重選別法を用いて相同組換えを行い、ES細胞に2つのloxPサイトを導入した。このES細胞をC57BL6マウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作成し、C57BL6マウスと戻し交配を行いF1マウスを得た。組織特異的にCre recombinaseを持つトランスジエニックマウスとホモ接合体を交配させ、遺伝子欠失マウスを同定した。Cx26の免疫蛍光染色で、ヘテロ変異マウスではコルチ器の支持細胞、ラセン靭帯の線維細胞から血管条の基底細胞にかけて豊富に分布していたが、ホモ変異マウスで発現が全体的に低下していた。トーンバーストを用いたABRにての聴力検査ではヘテロ変異マウスはどの周波数(8,12,16,20kHz)でも聴力域値が30dB以下なのに対し、ホモ変異マウスは70〜80dBと高度の難聴を認めた。また、周波数ごとにホモ変異マウスとヘテロ変異マウスの差をとると、高周波数になるにつれ差が大きくなった。基底回転と第2回転においてホモ変異マウスのコルチ器は高度に変性していた。頂回転ではコルチ器の崩壊は認めたが、基底回転や第2回転ほど高度ではなかった。ABRにてホモ変異マウスはヘテロ変異マウスと比較して高周波数の聴力のほうが低下しており、HE染色の基底回転側が高度に崩壊している所見と一致した。ホモ変異マウスのコルチ器の透過電顕所見では、内有毛細胞は保たれているが、外有毛細胞は変形しており、1列に減少していた。また、コルチトンネルの崩壊を認めた。支持細胞にも著明な変形がみられた。血管条とらせん靭帯には明らかな異常は認めなかった。細胞死の原因としてアポトーシスの関与を考え、検討した。ホモ変異マウスのコルチ器にはTUNEL、Caspase-3ともに数個の陽性細胞を認め、アポトーシスの関与が示唆された。タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションについての免疫染色を検討した。ZO-1ではコルチ器、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現を認め、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな発現の差はみられなかった。また、血管条の基底細胞にも同様の発現を認めた。β-catenin、E-cadherinの染色で代表されるアドヘレンスジャンクションでは同様にコルチ器の内リンパ側、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現し、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな差は認めなかった。

GJB2 was first discovered in 1997 and has the highest frequency of variation among the most common genes. The analysis of physiology and morphology of animals is carried out. In the presence of Cre recombinase, gjb2 gene translation domain is created. In addition, the same composition of ES cells was used for the introduction of alloxP receptors into ES cells. C57BL 6 is the only one that can be used for blastoderm injection. Tissue-specific Cre recombinase can be used to determine the mating behavior of conjugants and the genetic behavior of conjugants. Cx26 immunofluorescence staining showed that the distribution of Cx26 in sertoli cells, vascular cells and basal cells of vascular strips was rich, and the expression of Cx26 in sertoli cells, vascular strips and basal cells was low. The frequency range of ABR is less than 30dB, and the frequency range of ABR is 70 ~ 80dB. The difference between high frequency and low frequency is very large. The second loop of the base loop is different from the first loop. The height of the top and the bottom of the bottom are different. ABR staining is different from other staining methods, and it is consistent with those observed in high frequency staining. The inner hairy cells are protected, and the outer hairy cells are reduced.また、コルチトンネルの崩壊を认めた。Support cells are in the clear. The blood vessels are very tough and the blood vessels are abnormal. The cause of cell death and the relationship between cell death and cell death A number of positive cells were identified by TUNEL, Caspase-3, and the relationship between them was discussed. The color of the color ZO-1 is a kind of cell with a small number of cells and a small number of cells on the surface. The basal cells of the vascular strips were identified. The staining of β-catenin and E-cadherin represents the presence of different proteins in the inner part of the cell, a part of the cell, and a part of the surface of the cell.