口腔扁平上皮癌における細胞分裂制御遺伝子の発現解析

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H17年度までの結果から、RAD21分解産物のうち、80KDのものが口腔粘膜上皮において分化と関連する可能性があることが示唆された。そこで本年度はまず口腔扁平上皮癌培養細胞株に様々な分化誘導作用があるとされている試薬を添加し分解産物の産生を検索した。その結果、トリコスタチンAや5アザサイチヂン、レチノイン酸などにおいても同様の分解産物が検出された。さらに口腔粘膜上皮の分化と関連しているといわれるカルパインの影響を考え、分化誘導試薬とカルパインインヒビターを併用した検索を行った。細胞分画を行い、核と細胞質におけるRAD21分解産物の発現を検討した結果、分化誘導試薬とカルパインインヒビターを共に添加した細胞で、RAD21の80KD分解産物が細胞質において減少しているという結果を得た。この結果によりRAD21はカルパインによって分解され、その80KD分解産物は核から細胞質へと移行して細胞分化に関連している可能性が示唆された。並行して症例数を増やしたレーザーマイクロダイセクション法とウエスタンブロット法を用いた検索にいても分化との関連をさらに裏付ける結果となった。現在はカルパインによっていかなるポイントで分解されるかについて質量解析によって検索を試みているが、検索が難しく、ポイントミューテーションを用いた検索方法に変更するかについて検討中である。今回の研究では主にレーザーマイクロダイセクション法からのウエスタンブロット法を実現する為に、検出感度についての検討を多く行ったが本年度はさらに応用としてその手法を微量検体ではなく微量に発現しているタンパク質の検出に用いることを試みた。その結果、FRNKタンパク質を培養細胞から検出することに成功し、FRNKの機能解析にこの手法が大きく役立った。