歯周病関連細菌由来ストレス蛋白質による樹状細胞および抗原特異的T細胞の解析

使用源自牙周病相关细菌的应激蛋白分析树突状细胞和抗原特异性 T 细胞

基本信息

批准号：
17791568
负责人：
田中繁寿
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Aichi Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791568/
关键词：
HSP70 Actinobacillus Actinomycetemcomitans

项目摘要

申請者は昨年までの報告で目的タンパク質であるActinobacillus Actinomycetemcomitans由来DnaKの遺伝子を大腸菌コンピテントセルに導入したところまで報告した。1.その後、IPTGによる目的タンパク質の発現を確認するために何度かSDS-PAGEを行ったが、目的とする70kDa付近にタンパク質の発現を認めなかった。2.そのため、当初の計画にはなかったが導入した遺伝子が正しいものであるかを確認するためインサートプライマーを設計し、シークエンスにて塩基配列を確認した。結果、全配列を確認したわけではないが、開始コドンより1Kbase程度にわたり、目的の遺伝子の塩基配列は正しく組み込まれていることを確認した。3.その後、同施設の研究者の方々に相談し、IPTGによる目的タンパク質の誘導の段階において、なにかしらのエラーがあると考え、タンパク質発現の条件を変える(具体的には、試薬をもう一度チェックした後、タイムコース、IPTGの濃度変更)など何度か試してみたののタンパク質の発現がうまく認められなかった。ウエスタンブロットにより目的タンパク質の確認はできたが、タンパク質の精製の目的のためには発現量が少ないと考えた。以上より、シークエンスの結果から導入した遺伝子は目的タンパク質のものであることは確認したため、タンパク質合成の段階で、発現の誘導がうまく行えていないと考え同施設の研究者の方々に相談し、実験中である。具体的にはタンパク質回収の効率をあげることや発現ベクターをもう一度考え直すことなどを計画し、タンパク質精製が可能な程度の発現を目的に実験を継続している。

在一份报告中，直到去年，申请人甚至报告了靶蛋白的DNAK基因肌动杆菌静脉肌动症，引入了大肠杆菌胜任的细胞中。然后进行了几次SDS-PAGE，以确认IPTG确认靶蛋白的表达，但是在70 kDa的靶标周围未观察到蛋白质表达。 2。因此，尽管不在原始计划中，但设计了插入物引物来确认引入的基因是否正确，并且通过测序确认了碱基序列。结果，尽管我们没有确认整个序列，但可以证实，靶基因的基本序列已正确掺入起始密码子的大约1 kBase。 3。之后，我与设施的研究人员进行了咨询，并认为在IPTG诱导靶蛋白期间存在某种错误，因此我尝试了几次，例如改变蛋白质表达条件（具体而言，特别是在检查了试剂后改变了时间过程和IPTG浓度），但是蛋白质表达的表达再次不正确。尽管靶蛋白是通过蛋白质印迹证实的，但人们认为，出于蛋白质纯化的目的，表达水平很小。从上面的测序结果证实，引入的基因是靶蛋白的，因此，该公司在设施中咨询了研究人员，以研究实验，认为该基因在蛋白质合成阶段没有正确诱导表达。具体而言，我们计划提高蛋白质恢复的效率并重新考虑表达载体，并继续实验，目的是将其表达到允许蛋白质纯化的水平。