アプタマーを分子認識素子とした蛍光プローブの創製と細胞内イメージングへの応用

使用适体作为分子识别元件创建荧光探针及其在细胞内成像中的应用

• 批准号: 17750073
• 负责人: 宗 伸明
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17750073/
• 关键词: 蛍光プローブ; アプタマー; アデノシン三リン酸; 蛍光共鳴エネルギー移動; G-カルテット構造

本年度は、前年度までの結果を基に、プローブデザインを更に改善した新規アプタマー型プローブ、プローブIIIの開発を行った。具体的には、ATP認識DNAアプタマー(apt)(27mer)の5'末端に補足配列(add)(5mer)を付加したDNA(add-apt)に対し、相補的一本鎖DNA(comp)(12mer)をハイブリダイズさせ、add-aptの5'末端にドナー蛍光基、compの3'末端にアクセプター蛍光基を標識したものをプローブIIIとして設計し、その性能について検討した。まず、プローブIIIに対してArpを添加したところ、添加に伴う蛍光強度比I_D/I_A(I_DとI_Aはそれぞれドナー蛍光基とアクセプター蛍光基の蛍光強度)の増大が観測された。これは、Arpの認識に伴いプローブIII中の相補鎖DNAが解離し、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が解消されたためであると考えられる。蛍光強度比の変化と添加したArp濃度との間には相関が認められた。また、プローブIIIは、GTP、UTP、CTPには有意な蛍光応答を示さず、優れたヌクレオシド選択性を有していることが明らかとなった。更に、add-aptの3'末端に対して細胞膜透過性ペプチドを結合したプローブをRaw264細胞に適用し、蛍光顕微鏡観察を行ったところ、本プローブが細胞内に良好に導入されている様子を確認することができた。以上の結果から、プロ-ブIIIは新規Arp計測用蛍光プローブとして有用であると考えられ、本研究目標であるアプタマーを分子認識素子とした細胞内導入用蛍光プローブの開発に成功することができた。

This year, the results of the previous year were improved, and the development of the new model was improved. Specifically, ATP recognition DNA (apt)(27mer) 5'end complement (add)(5mer) DNA(add-apt) 5' end complement complement DNA(comp)(12mer) 5'end complement (add) 5' end The increase in the luminous intensity ratio I_D/I_A(I_D and I_A are opposite to the luminous intensity ratio I_D/I_A) is measured. In this paper, we discuss the relationship between DNA dissociation and fluorescence resonance (FRET). The intensity of light increases and decreases, and the concentration of light increases and decreases. In addition, the GTP, UTP and CTP are not intended to be used as a light source. In addition, the 3'terminal of the add-apt is suitable for use in Raw264 cells, and the 3' terminal of the add-apt is suitable for use in cells. The above results are useful for Arp measurement. The purpose of this study is to develop a new method for intracellular introduction of Arp.

项目成果

Methodology of reversible protein labeling for ratiometric fluorescent measurement

用于比率荧光测量的可逆蛋白质标记方法

• 发表时间: 2006
• 期刊: Mol. BioSyst. 2巻2号
• 作者: Hirohisa Nagatani;Toru Ozeki;Toshiyuki Osakai;Yan Li et al.;Nobuaki Soh et al.;Koji Hirakawa et al.;Yan Li et al.;Nobuaki Soh et al.
• 通讯作者: Nobuaki Soh et al.

Sequential injection chemiluminescence immunoassay for anionic surfactants using magnetic microbeads immobilized with an antibody

使用固定有抗体的磁性微珠对阴离子表面活性剂进行连续注射化学发光免疫分析

• 发表时间: 2005
• 期刊: Talanta 68巻2号
• 作者: Hirohisa Nagatani;Toru Ozeki;Toshiyuki Osakai;Yan Li et al.;Nobuaki Soh et al.;Koji Hirakawa et al.;Yan Li et al.;Nobuaki Soh et al.;Koji Hirakawa et al.;RuiQi Zhang et al.
• 通讯作者: RuiQi Zhang et al.

Electrochemical sandwich immunoassay for vitellogenin by sequential injection analysis using antibody immobilized magnetic microbeads

使用抗体固定磁微珠连续注射分析卵黄蛋白原的电化学夹心免疫分析

• 发表时间: 2006
• 期刊: Electroanalysis 18巻13-14号
• 作者: Hirohisa Nagatani;Toru Ozeki;Toshiyuki Osakai;Yan Li et al.;Nobuaki Soh et al.;Koji Hirakawa et al.
• 通讯作者: Koji Hirakawa et al.

Electrochemical Immunoassay for Vitellogenin Based on Sequential Injection Using Antigen-immobilized Magnetic Microbeads

• DOI: 10.2116/analsci.22.81
• 发表时间: 2006-01
• 期刊: Analytical Sciences
• 影响因子: 1.6
• 作者: Koji Hirakawa;M. Katayama;N. Soh;K. Nakano;T. Imato

Flow Immunoassay of Trinitrophenol Based on Surface Plasmon Resonance Sensor Using a One-Pot Immunoreaction with a High Molecular Weight Conjugate

基于表面等离子共振传感器的三硝基苯酚的流式免疫测定，使用高分子量缀合物的一锅免疫反应

• 发表时间: 2005
• 期刊: Talanta 68
• 作者: M.KOBAYASHI;M.SATO;Y.LI;N.SOH;K.NAKANO;K.TOKO;N.MIURA;K.MATSUMOTO;A.HEMMI;Y.ASANO;T.IMATO
• 通讯作者: T.IMATO