ラットPLA細胞由来の骨芽細胞を用いた三次元高密度培養法の確立および培養骨の作製

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1.ラット脂肪組織由来幹細胞の採取および骨芽細胞の分化誘導SPFラット(Wistar系、オス、体重100g)の側腹部から無菌的に採取した皮下脂肪組織を細断し、脂肪組織片に0.075%コラゲナーゼを加え細胞外基質の分解を行い、遠心分離後、間葉系幹細胞専用培地中で静置したところ、紡錘形を示す付着細胞の盛んな増殖が得られ、経代後も活発な細胞増殖が引き続き認められた。0.1μMデキサメタゾン、10mMβグリセロリン酸、50μMアスコルビン酸、rhBMP-2(200ng/ml)を添加し、骨芽細胞の分化誘導を試みた。アルカリフォスファターゼ染色(ALP)を行ったところ4〜6週後での細胞の染色の程度が増加し、脂肪組織由来幹細胞(PLA細胞)からの骨芽細胞への分化が示唆された。合成高分子からなるハイドロゲルであるメビオールジェルと幹細胞培地を混合し、培養皿上でφ5mm程度の半球状の三次元環境を作製して8週まで培養を行ったところ、ALP陽性の球状の細胞が三次元的に散見された。2.誘導骨芽細胞の三次元高密度培養三次元連続培養が可能なラジアルフロー型リアクターに、コラーゲンスポンジ担体を填入し、フラスコ上で増殖させたPLA細胞混合1週後に、還流培地を骨芽細胞分化培地に交換、rhBMP-2を添加(200ng/ml)し、幹細胞から誘導した骨芽細胞を連続培養したが、4週後にてコラーゲンスポンジ担体を標本処理し検鏡したところ、細胞成分はほとんどみられなかった。長期間良好な状態で連続培養を行うには、適切な担体の作製、培地還流速度の検索や、メビオールジェルの無菌的操作法の改良も必要と思われた。