スルフォニル尿素剤受容体の構造生物学的解析

磺酰脲受体的结构生物学分析

基本信息

批准号：
18890086
负责人：
木村泰久
金额：
$ 1.75万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18890086/
关键词：
スルフォニル尿素剤受容体構造解析

项目摘要

本研究は糖尿病治療薬のターゲットとして重要なスルフオニル尿素剤受容体の構造解析を実施し、スルフオニル尿素剤の作用機序及びインスリンの分泌メカニズムをタンパク質の立体構造から明らかにしようとするものである。この目的達成のため研究初年度(平成18年度)には以下の研究を行った。動物細胞による大量発現系の構築対象とするスルフオニル尿素受容体は巨大な膜タンパク質複合体であり高度な翻訳後の品質管理機構を必要とすることから動物細胞での発現系の構築が必須となる。そこで浮遊培養が可能な動物培養細胞(HEK293F)細胞を用いたい量発現系の構築を行った。遺伝子導入に安価な高分子ポリマーを使用することで、効果的かつ経済的な動物細胞大量培養系の構築に成功した。さらにバイオリアクターでの培養条件を決定し数十リットルスケールでのタンパク質発現を可能にするにいたった。蛍光ゲルろ過法による安定化条件の探索現段階において精製したスルフオニル尿素剤の安定性が乏しいことが解析の最も大きな妨げとなっている。そこでGFP融合タンパク質を用いて様々な塩やリガンド存在下での複合体の形成状況をゲルろ過法により調査し、複合体を安定な形状で水溶液中に存在させる条件の決定を試みた。緩衝液や塩、グリセロール濃度等影響を与えると思われる項目すべてについて検討を行い、安定に数日間複合体を維持できる溶液条件を見出した。

这项研究旨在分析磺酰脲受体的结构分析，这对于糖尿病药物的靶标很重要，并阐明了磺酰脲作用机理以及蛋白质三维结构中胰岛素分泌的机制。为了实现这一目标，在研究的第一年（2006年）进行了以下研究。磺酰脲受体是通过动物细胞构建大型表达系统的靶标，是一种巨大的膜蛋白复合物，需要复杂的翻译后质量控制机制，因此在动物细胞中构建表达系统至关重要。因此，使用悬浮的培养动物细胞（HEK293F）细胞构建了所需的表达系统。通过使用廉价的聚合物聚合物进行基因转移，我们成功地构建了一个有效且经济的大规模动物细胞培养系统。此外，确定生物反应器中的培养条件，从而使蛋白质表达在几十升的尺度上。通过荧光凝胶过滤寻找稳定条件，纯化的磺酰尿素剂的稳定性较差是分析的最大障碍。因此，使用GFP融合蛋白通过凝胶过滤研究了在存在各种盐和配体的情况下配合物的形成，并尝试以稳定形式以水性溶液中存在复合物存在的条件。我们调查了所有被认为具有效果的项目，例如缓冲液，盐，甘油浓度，并找到了使复合物稳定维持几天的溶液条件。