N-置換ホルムアミド代謝の分子レベルでの解明

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F164株由来N-置換ホルムアミドデポルミラーゼは、基質特異性およびアミノ酸配列の点で、既知の酵素と全く異なる新規デポルミラーゼであり、今後、その反応機構および立体構造の解明が期待される。一方、本菌株は、N-置換ホルムアミドデポルミラーゼのみならずイソニトリルヒドラターゼの酵素活性も同時に有している。本株の有するイソニトリルヒドラターゼ(2例目)のタンパク質・遺伝子レベル両面からの解析は、本酵素に関するさらなる学術的知見を与えるとともに、イソニトリルヒドラターゼとN-置換ホルムアミドデポルミラーゼの遺伝子レベルでの関係の解明が期待される。(1)N-置換ホルムアミドデポルミラーゼの結晶化の検討今回、N-置換ホルムアミドデポルミラーゼ酵素の構造遺伝子を導入した組換え体から、N-置換ホルムアミドデポルミラーゼ酵素標品を大量に調製した。現在、ハンギングドロップ蒸気拡散法により、得られた酵素標品の結晶化条件の検討を行っている。(2)F164株由来イソニトリルヒドラターゼの分子生物学的解析今回、F164株におけるイソニトリルヒドラターゼの至適発現条件を検討した。発現条件検討を行うにあたって、まず、本株の無細胞抽出液を用いたイソニトリルヒドラターゼ活性測定法を再構築した。次に、本酵素活性を指標として、各種培養条件を検討した。その結果、N-置換ホルムアミドを誘導剤として添加した栄養培地で、本株を培養することによって、本酵素発現量が基本条件の約5倍に上昇することが明らかとなった。また、各種栄養培地についても同様に検討してみたところ、別の栄養培地を用いることで最大の酵素発現量を得ることができた。現在、本至適培養条件下で大量に培養した本菌体を用いて、本酵素の精製条件を検討しているところである。