ボツリヌス毒素複合体タンパク質のサブユニット間相互作用領域の特定に関する研究

肉毒杆菌毒素复合蛋白亚基间相互作用区域的鉴定研究

• 批准号: 06J06210
• 负责人: 鈴木 智典
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J06210/
• 关键词: ボツリヌス菌; ボツリヌス毒素複合体; 血球凝集素; タンパク質-タンパク質相互作用; Far-western blot

ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)が産生するボツリヌス毒素は、毒素活性を有する神経毒素(BoNT)に、無毒なタンパク質である非毒非血球凝集素成分(NTNHA)および3種の血球凝集素成分(HA-70、HA-33およびHA-17)の合計5種類のタンパク質が会合したサブユニット構造を有する合計650kDaのタンパク質複合体である。無毒タンパク質群は、BoNTを消化管での酸性条件や種々のタンパク分解酵素から保護し、BoNTを腸管から標的細胞に送達するという極めて重要な役割を担っている。これまでの研究成果として、D型ボツリヌス毒素複合体(650kDa)は、BoNTおよびNTNHAが各1分子、HA-70が2分子、HA-33およびHA47が各4分子からなる12量体サブユニット構造であり、さらに、複合体構造における各サブユニットの立体的な配座を示した結合モデルを報告した。本研究は、さらに詳細なサブユニット間相互作用部位の特定を目的とした。今回、ボツリヌス毒素複合体サブユニットであるHA成分間の結合に着目し、HA-70分子上のHA-17結合領域を、Far-western blot法を用いて特定した。HA-70をV8プロテアーゼで限定分解したHA-70断片をSDS-PAGEし、分離したバンドをPVDF膜に転写した。PVDF膜の一方をCBB染色後、HA-70断片のN末端アミノ酸配列を分析し、もう一方にはHA-33/HA-17をプローブタンパク質として結合させ、Far-western blotを行った。その結果、C末端側の約7.5kDaの領域(Ser431〜Glu497)を共通して含む23〜70kDaの断片に、HA-33/HA-17が結合することが明らかとなった。従って、HA-70分子上のHA-17結合領域は、C末端側のSer431〜Glu497間の67残基に存在すると推定した。この結果は、ボツリヌス毒素複合体の構造を研究する上で、重要な知見になると考えられる。

A total of 5 types of non-toxic non-hemagglutinin components (NTNHA) and 3 hemagglutinin components (HA-70, HA-33 and HA-17) are produced by Clostridium botulinum, and a total of 650kDa hemagglutinin complexes are produced by non-toxic non-hemagglutinin components (NTNHA) and non-toxic non-hemagglutinin components (HA-70, HA-33 and HA-17). The non-toxic protein group and BoNT are the acid condition of the digestive tract, and the protective enzyme and BoNT are the important service factors for the delivery of the target cells of the intestinal tract. The results of this research are as follows: 1 molecule each of BoNT and NTNHA, 2 molecules each of HA-70, 12 molecules each of HA-33 and HA-47, 3 molecules each of HA-70 and HA-47. The purpose of this study is to specify the interaction sites between the two groups. This time, Far-western blot method was used to determine the binding between HA components of the toxin complex and the HA-17 binding domain on the HA-70 molecule. HA-70 fragments were separated by SDS-PAGE and PVDF membrane. One side of PVDF membrane was stained with CBB, the N-terminal amino acid alignment of HA-70 fragment was analyzed, and the other side of HA-33/HA-17 was analyzed with Far-western blot. As a result, a 7.5 kDa domain (Ser431 ~ Glu497) on the C-terminal side was common, including a fragment of 23 ~ 70kDa and HA-33/HA-17 binding. The HA-17 binding domain on HA-70 molecule is presumed to exist at residue 67 between Ser431 and Glu497 on the C-terminal side. The results show that the structure of the toxin complex is important for understanding.

项目成果

Quantitative detection of gene expression and toxin complex produced by Clostridium botulinum serotype D strain 4947

• DOI: 10.1016/j.mimet.2006.04.013
• 发表时间: 2006-12-01
• 期刊: JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS
• 影响因子: 2.2
• 作者: Kouguchi, Hirokazu;Suzuki, Tomonori;Ohyama, Tohru
• 通讯作者: Ohyama, Tohru

Identification of soluble proteins and relationship with mannan o on mucilage of Dioscorea opposita Thunb (Chinese yam tuber)

山药粘液中可溶性蛋白的鉴定及其与甘露聚糖的关系

• 发表时间: 2006
• 期刊: Food Science and Technology Research 12
• 作者: Yoneyama;T.;Shiozawa;M.;Niwa;K.;et al.;T.Suzuki et al.;T.Yoneyama et al.;K.Niwa et al.;T.Myoda et al.
• 通讯作者: T.Myoda et al.

Role of non-toxic components of serotype D botulinum toxin complex in permeation through a Caco-2 cell monolayer, a model for intestinal epithelium

D 血清型肉毒杆菌毒素复合物的无毒成分在通过 Caco-2 细胞单层（肠上皮模型）渗透中的作用

• 发表时间: 2007
• 期刊: FEMS Immunology Medical Microbiology (In press)
• 作者: Yoneyama;T.;Shiozawa;M.;Niwa;K.;et al.;T.Suzuki et al.;T.Yoneyama et al.;K.Niwa et al.
• 通讯作者: K.Niwa et al.

Expression and characterization of a recombinant unique acid phosphatase from kidney bean hypocotyl exhibiting chloroperoxidase activity in the yeast Pichia pastoris

来自芸豆下胚轴的重组独特酸性磷酸酶在毕赤酵母中表现出氯过氧化物酶活性的表达和表征

• 发表时间: 2007
• 期刊: Protein Expression and Purification 53
• 作者: Yoneyama;T.;Taira;M.;Suzuki;T.et al.
• 通讯作者: T.et al.

Effect of Nicking the C-terminal Region of the Clostridium botulinum Serotype D Neurotoxin Heavy Chain on its Toxicity and Molecular Properties.

肉毒杆菌血清型 D 神经毒素重链 C 末端区域的切口对其毒性和分子特性的影响。

• 期刊: Protein J. (In press)
• 作者: Suzuki T;et al.
• 通讯作者: et al.