ボツリヌス毒素複合体タンパク質のサブユニット間相互作用領域の特定に関する研究

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ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)が産生するボツリヌス毒素は、毒素活性を有する神経毒素(BoNT)に、無毒なタンパク質である非毒非血球凝集素成分(NTNHA)および3種の血球凝集素成分(HA-70、HA-33およびHA-17)の合計5種類のタンパク質が会合したサブユニット構造を有する合計650kDaのタンパク質複合体である。無毒タンパク質群は、BoNTを消化管での酸性条件や種々のタンパク分解酵素から保護し、BoNTを腸管から標的細胞に送達するという極めて重要な役割を担っている。これまでの研究成果として、D型ボツリヌス毒素複合体(650kDa)は、BoNTおよびNTNHAが各1分子、HA-70が2分子、HA-33およびHA47が各4分子からなる12量体サブユニット構造であり、さらに、複合体構造における各サブユニットの立体的な配座を示した結合モデルを報告した。本研究は、さらに詳細なサブユニット間相互作用部位の特定を目的とした。今回、ボツリヌス毒素複合体サブユニットであるHA成分間の結合に着目し、HA-70分子上のHA-17結合領域を、Far-western blot法を用いて特定した。HA-70をV8プロテアーゼで限定分解したHA-70断片をSDS-PAGEし、分離したバンドをPVDF膜に転写した。PVDF膜の一方をCBB染色後、HA-70断片のN末端アミノ酸配列を分析し、もう一方にはHA-33/HA-17をプローブタンパク質として結合させ、Far-western blotを行った。その結果、C末端側の約7.5kDaの領域(Ser431〜Glu497)を共通して含む23〜70kDaの断片に、HA-33/HA-17が結合することが明らかとなった。従って、HA-70分子上のHA-17結合領域は、C末端側のSer431〜Glu497間の67残基に存在すると推定した。この結果は、ボツリヌス毒素複合体の構造を研究する上で、重要な知見になると考えられる。