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タンパク質のリン酸化を蛍光レシオ検出する人工低分子ペプチドプローブの開発

用于蛋白质磷酸化荧光比值检测的人工低分子量肽探针的开发

基本信息

批准号：
06J09693
负责人：
野中洋
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

初年度(平成18年度)は、ハイパーリン酸化配列を認識する人工ペプチドプローブ分子の研究過程において、チロシンを基本骨格とする2核の亜鉛錯体DpaTyr/2Znの置換基にクロロアセチル基をもつプローブが、特定のアミノ酸配列(Cys-Ala6-Asp4)と親和性を有するだけでなく迅速に共有結合標識が可能であることを偶然発見した。これまで、人工低分子と短鎖ペプチド配列との組み合わせによる、共有結合標識手法はほぼ存在していない。そのため、このような配列をタンパク質標識のためのタグとして用いることで、新規のタンパク質標識手法として提案することを目指してきた。前年度(平成19年度)は、実際にタンパク質にタグを融合した状態で発現させ評価を行った。タグを導入したモデルタンパク質に対して、プローブとなるDpaTyr/2Zn誘導体を添加することで、完全水系において数十分という短時間でのラベル化が可能であった。続いてタンパク質間での選択性を評価するために、多種タンパク質共存下において同様の評価をおこなった結果、タグつきタンパク質に対して選択的な修飾が可能であった。本年度(平成20年度)は、Gタンパク質共役受容体に対して標識を試みた。受容体の細胞外領域にタグ配列を導入し、HEK293細胞に発現させた。この細胞を蛍光プローブで染色したところ、受容体を発現している細胞上に標識由来の蛍光が観測された。この蛍光は細胞膜上の受容体局在と一致したことから、タグ導入受容体に対する選択的な標識であることが示された。分子認識による選択性と化学反応の選択性を融合させた本手法が、夾雑系において有効なタンパク質標識手法となりうることを示すことができた。本手法は生体機能を支える重要なタンパク質の局在や動態を観測するバイオイメージング研究や、タンパク質工学のための分子ツールとしての貢献が期待できると思われる。

At the beginning of year (pp.47-53 18 year) は, ハイパーリン acidification with column を know する artificial ペプチドプローブ molecular の process において, チロシンを basic skeleton とする 2 nuclear の亜 lead misprinted DpaTyr / 2 zinc の replacement base にクロロアセチル base をもつプローブが, specific のアミノ acid with column (Cys - Ala6 - Asp4)と affinity を has するだけでなく rapid に common binding markers が may であるであるとを occasional occurrence たた. これまで, artificial low molecular と short lock ペプチド match column との group み close わせによる, combined with identification technique はほぼ exist していない. そのため, このような match column をタンパク qualitative identification のためのタグとして in いることで, new rules のタンパク qualitative identification technique として proposal することを refers してきた. The previous year (Heisei 19) witnessed the occurrence of させ evaluation 価を performance った in the にタ, パ, パ, <s:1> and た states of <s:1> and にタグを fusion in the real world. タグを import したモデルタンパク qualitative にし seaborne て, プローブとなる DpaTyr / 2 zinc inductor を add することで, complete drainage において scores points という short でのラベル change が may であった. 続いてタンパク mass between での sentaku sex を review 価するために, multiple タンパク mass under the coexistence において with others の review 価をおこなった results, タグつきタンパク qualitative にし seaborne て sentaku な modified が may であった. In this year (Heisei 20), the に and Gタパパ <s:1> co-active acceptors of the <s:1> are tested against the て identification を of the みた. The receptor is present in the extracellular domain にタグ in coordination with を for introduction to を, and HEK293 cells に occur させた. この cells を蛍 light プローブで dyeing したところ, let body を発 now しているに logo on cell origin の蛍 light が観 measuring された. この蛍 light はの popularity on the cell membrane, let body bureau in と consistent したことから, タグ import by the capacity of body にす seaborne る sentaku な logo であることが shown された. Molecular recognition による sentaku と chemical anti 応の sentaku を confluence させた this gimmick が, clip 雑において have sharper なタンパク qualitative identification technique となりうることを shown すことができた. This technique は raw body function with をえる important なタンパク qualitative の bureau in や dynamic を観 measuring するバイオイメージング research や, タンパク quality engineering のための molecular ツールとしての contribution が expect できると think われる.