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網羅的RNAiライブラリーを用いたマスト細胞の脱顆粒メカニズムの解明

使用综合 RNAi 文库阐明肥大细胞脱颗粒机制

基本信息

批准号：
06J11245
负责人：
菅生厚太郎
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、独自に開発したRNAiライブラリー構築技術であるEPRIL法を活用し、マスト細胞における抗原感作時に引き起こされる脱顆粒に関与する遺伝子を網羅的に同定することを目的としている。平成20年度においては、昨年度までに行ったライブラリースクリーニングによってリストアップされた候補遺伝子について、研究計画に従い、(1)siRNAの導入によってその標的遺伝子の発現レベルが低下しているか?(2)同一遺伝子を標的とする異なる配列を持つsiRNAにより脱顆粒が抑制されるか?(3)抑制された脱顆粒が、その標的遺伝子を過剰発現することで復活するか?を調べることで、真に脱顆粒に関与する遺伝子を同定することを試みた。(1)及び(3)に関しては、市販されている定量的PCR用プライマー、ウェスタンブロッテイング用抗体、遺伝子発現ベクターなどを用いることができる。しかしながら、(2)に関しては、各候補遺伝子につき複数種類のsiRNAを用意する必要があるが、市販されているsiRNAは非常に高価であり、また必ずしも強い抑制効果を有していないため、本研究に用いるには相応しくない。任意の遺伝子について複数種類のsiRNAベクターを作製することは、EPRIL法を用いることで実現可能であるが、現行のEPRIL法は確実性を重視するため、冗長な酵素反応や不活化の工程が採られており、多種類の遺伝子についてそれぞれのsiRNAベクターを作製するという目的には適していない。そこで、EPRIL法の工程を簡略するとともに、マルチウェルフォーマットと自動分注機を導入することでスループットの向上を図った。その結果、改良型のEPRIL法においては、数100種類の標的遺伝子につきそれぞれ数1000種類のsiRNAベクターを数日以内に作製することが可能となった。この方法を用いて実際に候補遺伝子についてsiRNAベクターを複数種類作製し、上記(1)〜(3)の確認実験を行った。

This study is aimed at developing RNAi RNA construction techniques independently and using the EPRIL method to identify the presence and absence of DNA in cells. In 2010, the research project was carried out in 2010.(1)siRNA introduction, target gene development and gene expression were carried out in 2010. (2)The same gene target is different from each other in the sequence of siRNA. (3)Suppress the occurrence of particles, particles, and particles in the target DNA. The first step is to adjust the particle size and particle size. (1)and (3) quantitative PCR with antibodies, gene development with antibodies, and quantitative PCR with antibodies. (2) Each candidate gene has the intention to produce a plurality of siRNAs, and the siRNAs in the market are very high and strong, and the results of this study are relatively high. The EPRIL method can be used in the production of multiple kinds of siRNA. The accuracy of the current EPRIL method should be emphasized. The enzyme inactivation engineering should be adopted. The multiple kinds of siRNA can be used in the production of multiple kinds of siRNA. The EPRIL method is simple and easy to implement. The results showed that the modified EPRIL method could be used to detect more than 100 types of target siRNA within a few days. This method uses multiple types of siRNAs to identify candidate genes, and confirms the implementation of (1) to (3) above.