X線結晶構造解析による、脱アミノ化酵素の作用機構及び基質認識機能の解明

通过X射线晶体结构分析阐明脱氨酶的作用机制和底物识别功能

• 批准号: 06J11473
• 负责人: 倉谷 光央
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J11473/
• 关键词: APOBEC3G; HIV-1 Vif; Cul5; デアミナーゼ; Vif

APOBEC3Gと相互作用するタンパク質との複合体の調製を中心に行った。大量調製に成功しているHIV-1 Vifと、それと相互作用するユビキチンリガーゼの構成要素であるタンパク質であるヒトElongin B、Cとの複合体は、溶解度が低いという問題点があるため、さらに別のユビキチンリガーゼ構成要素を加えて、複合体の性質を改良することを考え、ユビキチンリガーゼ構成要素の中で最大サブユニットのヒトCullin 5(Cul5)に関して、大腸菌を用いた調製法を検討した。ヒトCul5は780アミノ酸からなる。タグの異なる種々のベクターにヒトCul5全長を組み込んで、大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させた。培養温度を振った幾つかの条件全てで、SDS-PAGEの泳動結果不溶性画分にはCul5と推定される位置に、発現誘導した菌ではしていない菌と比較して明らかなバンドが見られたが、可溶性画分では優位な差は見られなかった。既に構造が決定されているヒトCul2の構造を元にCul5のモデル構造を作成し、Vifが相互作用することが知られている前半部分の断片を調製した。Cul5の前半部分のN端にGSTタグを付加し、融合タンパク質として大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させ、大量調製した。可溶性画分にサンプルが得られた。グルタチオンカラムを用いて融合タンパク質を精製しプロテアーゼを用いてN端のGSTタグを切り離した。タグを切断した後も可溶性を保っていたため、他のタンパク質との複合体を形成させるための条件検討を行った。精製できた複合体に関して市販のスクリーニング試薬を用いて、ハンギングドロップ法を用いた結晶化を行ったが、これまでに結晶は得られていない。

The APOBEC3G interaction is the center of the complex. A large number of successful HIV-1 Vif, multiple interactions, complex B, complex, low solubility, low temperature, low solubility, high solubility, low solubility, high solubility, low solubility, low solubility, high solubility, low solubility, low solubility, high solubility, low solu Cullin 5 (Cul5) is the largest component in the elements, and the fungus is used in this method. Cul5 780s are sour and sour. All kinds of products can be used to improve the quality of Cul5. All kinds of bacteria can be used to improve the performance. The results of SDS-PAGE swimming test showed that the conditions of temperature vibration test were complete, the results of Cul5 swimming were insoluble, the position of bacteria was presumed, the temperature of bacteria was detected, the temperature of bacteria was detected, and the position of soluble picture was different. It is decided that the components are Cul5, the Cul2, and the Vif are interacting, and that the first half is the fragment. In the first half of the Cul5, the N-terminal GST was added, and the fusion system was used to replace the bacteria in the first half. The soluble painting is divided into different parts. This is the first time to use the fusion method to fuse the data. To use the N-terminal GST to cut the quarantine. After cutting off the cuttings, the soluble compounds were cut off, and the complex was formed in order to form a complex. The results show that the synthesis of the complex is not feasible in the market, and the method of crystallization is used to obtain the results of the synthesis.

项目成果

[tRNA^<Ile>リシジン合成酵素 TilS の反応メカニズム][古細菌tRNAメチル基転移酵素aTrm56の構造機能解析]

[tRNA^<Ile>赖氨酸合成酶TilS的反应机制] [古菌tRNA甲基转移酶aTrm56的结构和功能分析]

• 发表时间: 2008
• 作者: 倉谷 光央;吉川 由香;別所 義隆;東島 今日子;石井 健;柴田 理恵;高橋 征三;油谷 克英;横山 茂之;倉谷光央
• 通讯作者: 倉谷光央

Structural basis of the initial binding of tRNA^<ne> lysidine synthetase TilS with ATP and L-lysine

tRNA^<ne>赖氨酸合成酶 TilS 与 ATP 和 L-赖氨酸初始结合的结构基础

• 发表时间: 2007
• 期刊: Structure 15巻・12号
• 作者: 倉谷 光央;吉川 由香;別所 義隆;東島 今日子;石井 健;柴田 理恵;高橋 征三;油谷 克英;横山 茂之
• 通讯作者: 横山 茂之

Crystal structure and mutational study of a unique SpoU family archaeal methylase that forms 2'-O-methvlcytidine at position56 of tRNA

在 tRNA 56 位形成 2-O-甲基胞苷的独特 SpoU 家族古菌甲基化酶的晶体结构和突变研究

• 发表时间: 2008
• 期刊: Journal of Molecular Biology 375巻・4号
• 作者: 倉谷 光央;別所 義隆;西本 まどか;Henri Grosjean;横山 茂之
• 通讯作者: 横山 茂之