X線結晶構造解析による、脱アミノ化酵素の作用機構及び基質認識機能の解明

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APOBEC3Gと相互作用するタンパク質との複合体の調製を中心に行った。大量調製に成功しているHIV-1 Vifと、それと相互作用するユビキチンリガーゼの構成要素であるタンパク質であるヒトElongin B、Cとの複合体は、溶解度が低いという問題点があるため、さらに別のユビキチンリガーゼ構成要素を加えて、複合体の性質を改良することを考え、ユビキチンリガーゼ構成要素の中で最大サブユニットのヒトCullin 5(Cul5)に関して、大腸菌を用いた調製法を検討した。ヒトCul5は780アミノ酸からなる。タグの異なる種々のベクターにヒトCul5全長を組み込んで、大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させた。培養温度を振った幾つかの条件全てで、SDS-PAGEの泳動結果不溶性画分にはCul5と推定される位置に、発現誘導した菌ではしていない菌と比較して明らかなバンドが見られたが、可溶性画分では優位な差は見られなかった。既に構造が決定されているヒトCul2の構造を元にCul5のモデル構造を作成し、Vifが相互作用することが知られている前半部分の断片を調製した。Cul5の前半部分のN端にGSTタグを付加し、融合タンパク質として大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させ、大量調製した。可溶性画分にサンプルが得られた。グルタチオンカラムを用いて融合タンパク質を精製しプロテアーゼを用いてN端のGSTタグを切り離した。タグを切断した後も可溶性を保っていたため、他のタンパク質との複合体を形成させるための条件検討を行った。精製できた複合体に関して市販のスクリーニング試薬を用いて、ハンギングドロップ法を用いた結晶化を行ったが、これまでに結晶は得られていない。