藍藻ホスホリブロキナーゼのX線構造解析による反応機構と活性制御機構の解明

通过蓝绿藻磷酸脂激酶的X射线结构分析阐明反应机制和活性控制机制

• 批准号: 18770087
• 负责人: 松村 浩由
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770087/
• 关键词: 藍藻; ホスホリブロキナーゼ; X線構造解析; 反応磯構; 活性制御機構; 反応機構

本研究は,藍藻ボスホリブロキナーゼ(PRK)の反応機構ならびに活性調節機構をX線構造解析によって解明することを目的とし,以下の実験を行った。藍藻Synecococcus由来PRKの大量培養・精製系を構築した。精製手順は、藍藻PRKを大量に生産した大腸菌を破砕し,硫安分画,Niアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製を行った。その後、動的溶液光散乱法装置(DLS)を用いて,溶液状態でのサンプルの結晶化能を確認した。続いて、His-tagドメインを有した酵素を用いて、結晶化を行った。恒温インキュベータ(20℃と4℃)で、種々の結晶化条件の検討を行ったところ、PEG3350を沈殿剤として用いた条件で、0.2x0.2x0.2mm程度のX線回折実験に適した大きさの単結晶を作成することに初めて成功した。しかし、大型放射光施設Spring-8にてX線回折実験を行ったところ回折能3.8Å程度と、構造解析には不十分であった。次に,ThrombinによってHis-tagドメインを切断し、さらに、PRKの本体をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。その後、結晶化を行ったところ,0.05mm程度の単結晶を作成することに成功したが、大きさが不十分であり、構造解析可能な回折データが得られなかった。次に、PRKの活性調節因子であるCP12タンパク1質の精製系の構築にとりくんだ。PRKとCP12の結合をpull-downassayにて確認したが、結晶が得られなかった。続いて、CP12タンパク質のPRK結合ペプチドを合成し、PRKとCP12の結合をpull-down assayにて確認し、その後結晶化を行ったところ、0.05mm程度の単結晶を作成することができた。現在、結晶の改善を目指し、PRKとCP12ペプチド複合体の結晶化を行っている。

This study は, cyanobacteria ボ ス ホ リ ブ ロ キ ナ ー ゼ (PRK) の な 応 authorities ら び に activity regulating mechanism を X-ray structural analysis に よ っ て interpret す る こ と を purpose と し, the following の be 験 を line っ た. The cyanobacteria Synecococcus originated from PRK を. Large-scale cultivation and refinement of the series を. Construction of the species た. は refined hand, cyanobacteria PRK を large に production し た coliform を broken 砕 し, sulfur content, Ni ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー, ゲ filtration ク ル ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で refined を line っ た. After そ そ, the moving solution light dispersion device (DLS)を is confirmed by そ て, the state of the solution で, サ, プ, プ and <s:1> crystallization energy を to た た. 続 い て, ihs - tag ド メ イ ン を have し を た enzyme with い change line を っ て, crystallization た. Thermostatic イ ン キ ュ ベ ー タ (20 ℃ と 4 ℃) で, kind of 々 の crystallization conditions の 検 line for を っ た と こ ろ, PEG3350 を Shen Dian tonic と し て in い で た conditions, 0.2 x0.2 x0.2 mm degree の X-ray inflexion be 験 に optimum し た big き さ の 単 crystallization を made す る こ と に early め て successful し た. し か し radiation light facilities, large Spring - 8 に て X-ray inflexion be 験 を line っ た と こ ろ と inflexion can 3.8 A degree, structure parsing に は not quite で あ っ た. に, Thrombin に よ っ て ihs - tag ド メ イ ン を cut し, さ ら に, PRK の ontology を ゲ filtration ク ル ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り refined し た. Line, after そ の crystallization を っ た と こ ろ, degree of 0.05 mm の 単 crystallization を made す る こ と に successful し た が, big き さ が not quite で あ り, structure parsing may な inflexion デ ー タ が have ら れ な か っ た. The secondary に, PRK <s:1> activity regulatory factor であるCP12タ <e:1> パ <s:1> 1 high-quality <s:1> refined system <s:1> constructs にと くんだ くんだ. PRKとCP12 <s:1> combined with をpull-downassayにて confirmed <s:1> たが and crystallized が to られな たが った った. 続 い て, CP12 タ ン パ ク qualitative の PRK combining ペ プ チ ド を synthetic し, PRK と CP12 の combining を pull - down assay に て confirm し, そ の after crystallization を line っ た と こ ろ, degree of 0.05 mm の 単 crystallization を made す る こ と が で き た. Now, the crystallization <s:1> improves the を target of the <s:1> crystallization of the <s:1> PRKとCP12ペプチド complex を and って る る る.

项目成果

第5版 実験化学講座 5 化学実験のための基礎技術

第5版实验化学课程5化学实验基本技术

• 发表时间: 2006
• 作者: 井上 豪;松村浩由;甲斐 泰
• 通讯作者: 甲斐 泰

Enzymatic Characterization of 5-Methylthioribose l-Phosphate Isomerase from Bacillus subtilis.

枯草芽孢杆菌 5-甲基硫核糖 L-磷酸异构酶的酶学表征。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Biosci. Biotechnol. Biochem. 71巻
• 作者: Y. Saito;et. al.
• 通讯作者: et. al.

Structural, thermodynamic, and mutational analyses of a psychrotrophic RNase HI

• DOI: 10.1021/bi7001423
• 发表时间: 2007-06-26
• 期刊: BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.9
• 作者: Tadokoro, Takashi;You, Dong-Ju;Kanaya, Shigenori
• 通讯作者: Kanaya, Shigenori

Crystal structure of 5-methylthioribose l-phosphate isomerase product complex from Bacillus subtilis: Implications for catalytic mechanism.

枯草芽孢杆菌 5-甲基硫核糖 L-磷酸异构酶产物复合物的晶体结构：对催化机制的影响。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Protein Science 17巻
• 作者: H. Tamura;et. al.
• 通讯作者: et. al.

Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of glycerol kinase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis

超嗜热古菌 Thermococcus kodakaraensis 甘油激酶的结晶和初步 X 射线衍射研究

• 发表时间: 2007
• 期刊: Acta Crystallographica Section F 63巻2号
• 作者: R.Katsumi;Y.Koga;D.-J.You;H.Matsumura;K.Takano;S.Kanaya
• 通讯作者: S.Kanaya