ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼリン酸化酵素の結晶構造解析

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶的晶体结构分析

• 批准号: 14780523
• 负责人: 松村 浩由
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780523/
• 关键词: PEPカルボキシラーゼ; 炭酸固定酵素; C4植物; トウモロコシ; NADP-リンゴ酸酵素; PEPC-PK; X線構造解析; 分子機構解明; PEPC-Protein Kinase; 活性調節機構; フラベリア; 炭酸固定

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)は、C4植物で光合成初期炭酸固定反応を触媒している酵素である。PEPCをイネに高発現させることによって、炭酸固定効率が増大し、光合成の酸素阻害が低減されるとの報告があったが(Nature Biotech.17,76-80(1999))、その後の報告で、イネで高発現したPEPCは必ずしもその酵素活性を最大限に発揮していない可能性が示唆されている。PEPCの活性調節がうまく機能していないのが原因であると考えられている。そこで、我々はPEPCの活性調節機構の全容解明に向けてPEPC-PKの結晶構造解析を目指ざし、以下の実験を進めた。C4植物フラベリア由来PEPC-PKの大量精製系を二種類(pET16b,His-tagged酵素とpeT43a,thrombin処理酵素)確立し、大量精製に成功した。その後の恒温インキュベータ(20℃と4℃)で、結晶化を行ったところ、0.05mm程度の大きさの結晶を作成することに成功したが、SPring-8にてX線回折実験を行ったところ回折能8.0Å程度と構造解析には不十分なデータしか得られなかった。更なる結晶の品質向上を目指し、溶液状態を制御による結晶の品質およびサイズを向上させる技術を開発した(Jpn.J.Appl.Phys 43,L79-L81(2004))。現在、本技術を用いて結晶化を行っている。更に、PEPCの立体構造に基づくアロステリック活性調節機構に関する論文1報と総説2報を報告した(Structure 10,1721-1730(2002),Arch.Biochem.Biophys.414,170-179(2003),Annual Review Plant Biol.(2004)in press.)。また、PEPCはリンゴ酸などの有機酸によって活性阻害されることが知られているが、生体内でそのリンゴ酸を生成する酵素NADP依存型リンゴ酸酵素の精製・結晶化にも取り組んだ。NADP-リンゴ酸酵素については、微結晶を得ており(0.1mm程度)、5.0Å分解能の回折能を示す結晶を得ている。

ホ ス ホ エ ノ ー ル ピ ル ビ ン acid カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ (PEPC) は, C4 plants で early photosynthetic carbon acid fixed 応 を catalyst し て い る enzyme で あ る. High PEPC を イ ネ に 発 now さ せ る こ と に よ っ て, carbon acid が raised large し fixed working rate, photosynthetic の acid element resistance against が low cut さ れ る と の report が あ っ た が (Nature Biotech. 17,76-80 (1999)), そ の で の report, after イ ネ で high 発 now し た PEPC は will ず し も そ の enzyme activity を the deadline に 発 swing し て い な が い possibility in stopping さ れ て い る. The <s:1> activity of PEPC regulates the がうまく function て な な が が, and the reason for this is であると examination of えられて る る. そ こ で, I 々 は PEPC の activity regulating mechanism の let all interpret に to け て PEPC - PK の crystallization structure を refers ざ し, the following の be 験 を into め た. The C4 plant フラベリア originated from PEPC-PK and a large number of refined lines を two species (pET16b,His-tagged enzyme とpeT43a,thrombin treatment enzyme) were established, and the large number of refined lines に were successfully refined, and <s:1> た. After そ の の thermostatic イ ン キ ュ ベ ー タ (20 ℃ と 4 ℃) で, crystallization を line っ た と こ ろ, degree of 0.05 mm の big き さ の crystallization を made す る こ と に successful し た が, SPring - 8 に て X-ray inflexion be 験 を line っ た と こ ろ inflexion can 8.0 A degree と structure に は not quite な デ ー タ し か must ら れ な か っ た. More な る crystallization の quality up を refers し and solution state を suppression に よ る crystallization の quality お よ び サ イ ズ を upward さ せ る technology を open 発 し た (Jpn. J.A PPL. 43, Phys L79 - L81 (2004)). Now, this technology を crystallizes を rows って る る る. More に, PEPC の three-dimensional Structure に base づ く ア ロ ス テ リ ッ ク activity regulating mechanism に masato す る paper 1 quote と 総 said 2 quote を report し た (Structure 10172 1-1730 (2002), the Arch. Biochem. Biophys. 414170-179 (2003), the Annual Review Plant. Biol. (2004), in press). ま た, PEPC は リ ン ゴ acid な ど の organic acid に よ っ て active resistance against さ れ る こ と が know ら れ て い る が, born in vivo で そ の リ ン ゴ acid を generated す る enzyme NADP dependent type リ ン ゴ acid enzyme の refined, crystallization に も group take り ん だ. NADP - リ ン ゴ acid enzyme に つ い て は, micro crystal を て お り degree (0.1 mm), 5.0 A decomposition can の inflexion can を shown す crystallization を て い る.

项目成果

Yamamoto, T.: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of TBP-interacting protein from the typerthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis strain KOD1"Acta Cryst.. S59. 372-374 (2003)

Yamamoto, T.：“来自嗜热古菌 Thermococcus kodakaraensis KOD1 菌株的 TBP 相互作用蛋白的结晶和初步 X 射线分析”Acta Cryst.. S59。

Mizohata, E.: "Crystal Structure of Activated Ribulose-1,5-bisphosphate Carboxylase/Oxygenase from Green Alga Chlamydomonas reinhardtii Complexed with 2-Carboxyarabinitol-1,5-bisphosphate globisporus"J.Mol.Biol.. 316. 679-691 (2002)

Mizohata，E.：“绿藻莱茵衣藻与 2-羧基阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸球孢菌复合的活化核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的晶体结构”J.Mol.Biol.. 316. 679-691

Inoue, T.: "The significance of the flexible loop in the azurin (Az-iso2) from the obligate methylotroph Methylomonas sp.strain J."J.Mol.Biology. 333. 117-124 (2003)

Inoue, T.：“来自专性甲基营养菌甲基单胞菌菌株 J 的天青蛋白 (Az-iso2) 中柔性环的重要性。”J.Mol.Biology。

Adachi, H.: "Laser Irradiated Growth of Protein Crystal."Jpn.J.Appl.Phys.. 42. 798-800 (2003)

Adachi, H.：“蛋白质晶体的激光照射生长”Jpn.J.Appl.Phys.. 42. 798-800 (2003)

Y.Okano, et al.: "X-ray structure of Galdieria Rubisco complexed with one sulfate ion per active site"FEBS Lett.. 527. 33-36 (2002)

Y.Okano 等人：“每个活性位点与一个硫酸根离子复合的 Galdieria Rubisco 的 X 射线结构”FEBS Lett.. 527. 33-36 (2002)