リンドウで見出された新規な外来遺伝子発現抑制現象の解明

阐明龙胆中发现的新型外源基因表达抑制现象

• 批准号: 18780023
• 负责人: 三柴 啓一郎
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780023/
• 关键词: リンドウ; 遺伝子導入; 発現抑制; DNAメチル化; Agrobacterium; 園芸学

本研究は,リンドウで見出された35Sプロモーターに特異的な発現抑制現象の解明を目的としている。本年度は35Sプロモーターの重要なエレメントであるas-1に結合する因子がDNAメチル化誘導に関与している可能性を検討するために,改変35Sプロモーターを導入した組換えリンドウを作出し,通常型35Sプロモーターと同様にDNAメチル化が引き起こされるかを調査した。as-1エレメントを改変した35Sプロモーター,また35SプロモーターのAドメイン(-90より下流)をリンドウやペチュニアのCHSコアプロモーター(G-boxを含む領域)に置換した改変プロモーターをsGFP遺伝子に連結したコンストラクトを作成し,アグロバクテリウム法でリンドウに導入した。得られた多数の組換え植物体より,シングルコピーでT-DNAが導入された系統をサザン解析により選抜した。これらシングルコピー系統について,導入された改変プロモーターからsGFP5側までの領域におけるメチル化シトシン配列の頻度を,Bisulfite法で解析した。その結果,通常型35Sプロモーター領域と同様に,調査した全ての系統で改変35Sプロモーター領域の高度なメチル化が確認された。このようにメチル化がas-1エレメントやコアプロモーター配列に非依存的に起きていることから,これらの配列はメチル化の引き金に直接的に関与していないものと考えられた。さらに非CG/CWG配列(CHH)におけるde novoメチル化頻度を詳細に解析したところ,as-1エレメントの5'側上流域において高頻度にde novoメチル化が起きていることが判明し,この領域が発現抑制の誘導に関わっていることが推察された。

这项研究旨在阐明gentian中35S启动子的表达抑制现象。在今年，为了调查结合35S启动子的重要元素AS-1的药物参与DNA甲基化的诱导，我们创建了重组的绅士，并引入了改良的35S启动子并研究了DNA甲基化是否以常规35S启动子的方式引起。创建了一个构造，其中35S启动子被35S启动子（一个包含G-box的区域）的A域（下游）替换为Gentian或petunias的区域，并使用农业类方法将其引入了SGFP基因。从获得的众多重组植物中，通过Southern Analysis选择了在单个副本中引入T-DNA的菌株。对于这些单拷贝菌株，通过Bisulfite方法分析了从引入的修饰启动子到SGFP5侧的区域中甲基化的胞嘧啶序列的频率。结果，以及常规的35S启动子区域，在所有研究的菌株中确认了改良的35S启动子区域的高度甲基化。因此，甲基化是独立于AS-1元素和核心启动子序列发生的，因此人们认为这些序列与甲基化的触发触发无直接涉及。此外，对非CG/CWG序列（CHH）中从头甲基化频率进行的详细分析表明，从头甲基化经常发生在AS-1元素的5'上游区域中，并且可以推断出该区域参与诱导表达抑制。