リンドウで見出された新規な外来遺伝子発現抑制現象の解明

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本研究は,リンドウで見出された35Sプロモーターに特異的な発現抑制現象の解明を目的としている。本年度は35Sプロモーターの重要なエレメントであるas-1に結合する因子がDNAメチル化誘導に関与している可能性を検討するために,改変35Sプロモーターを導入した組換えリンドウを作出し,通常型35Sプロモーターと同様にDNAメチル化が引き起こされるかを調査した。as-1エレメントを改変した35Sプロモーター,また35SプロモーターのAドメイン(-90より下流)をリンドウやペチュニアのCHSコアプロモーター(G-boxを含む領域)に置換した改変プロモーターをsGFP遺伝子に連結したコンストラクトを作成し,アグロバクテリウム法でリンドウに導入した。得られた多数の組換え植物体より,シングルコピーでT-DNAが導入された系統をサザン解析により選抜した。これらシングルコピー系統について,導入された改変プロモーターからsGFP5側までの領域におけるメチル化シトシン配列の頻度を,Bisulfite法で解析した。その結果,通常型35Sプロモーター領域と同様に,調査した全ての系統で改変35Sプロモーター領域の高度なメチル化が確認された。このようにメチル化がas-1エレメントやコアプロモーター配列に非依存的に起きていることから,これらの配列はメチル化の引き金に直接的に関与していないものと考えられた。さらに非CG/CWG配列(CHH)におけるde novoメチル化頻度を詳細に解析したところ,as-1エレメントの5'側上流域において高頻度にde novoメチル化が起きていることが判明し,この領域が発現抑制の誘導に関わっていることが推察された。