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ムチン型糖鎖糖転移酵素欠損患者にみられる家族性腫瘍性石灰化沈着症の発症機構

在粘蛋白型糖基转移酶缺陷患者中观察到的家族性肿瘤钙化病的发病机制

基本信息

批准号：
18790215
负责人：
小代田宗一
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Akita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790215/
关键词：
糖鎖糖転移酵素 FGF23

项目摘要

本研究ではGALNT3変異による家族性腫瘍性石灰化沈着症発症機構を解明するため、FGF23の糖鎖修飾に着目した。前年度で解析したGALNT3の発現とFGF23の分子安定性の関連をさらに解析するため、Po1 II系プロモーターを持つRNAi発現ベクターを用いてGALNT3を含む複数のGALNTアイソフォームに対して特異的RNAiコンストラクトを作製しHEK293細胞に一過性あるいは恒常的に発現させた。このRNAi発現細胞にC末端にV5およびHisタグ配列を付加したFGF23をHEK293細胞に一過性に発現させた。解析の結果、GALNT3を特異的に抑制したHEK293細胞で培養上清中のFGF23分子の顕著な減少を確認した。次に分解前の状態のFGF23の糖鎖修飾を解析するため、FGF23分子のプロテアーゼ切断部位をアミノ酸置換したR176QおよびR179Q変異型FGF23をHEK293細胞に導入した。ウェスタンブロット解析から、完全長FGF23の分子サイズに複数のバンドを確認した。分子サイズの変化は糖鎖修飾によるものと考えられた。さらに、糖鎖修飾部位を解析するため、プロテアーゼ切断部位にあるT178スレオニン残基をアラニンに置換したR176Q T178A変異型FGF23コンストラクトを作製し同様に解析したところ、糖鎖修飾による複数のバンドは消失し、1本の完全長FGF23を示すバンドのみを確認した。この結果から、HEK293細胞においてFGF23のムチン型糖鎖修飾部位はT178であり、この部位のムチン型糖鎖修飾にバリエーションがあることが明らかとなった。野生型FGF23とR176Q T178A変異型FGF23の比較解析から、T178への糖鎖修飾はFGF23の分子安定性に重要であり、GALNT3はその部位への糖鎖修飾によりFGF23の分子安定性に寄与していると考えられた。

This study focused on understanding the mechanism of familial ulcerative calcification by GALNT3 and FGF23 glycophytic modification. The relationship between the occurrence of GALNT3 and the molecular stability of FGF23 was analyzed in the previous year. The expression of GALNT3 in PO1 II cells was detected by RNAi. The expression of GALNT3 in HEK293 cells was transient or constant. The RNAi gene was transiently detected in HEK293 cells by adding V5 and His protein to the C-terminal region. As a result of the analysis, GALNT3-specific inhibition was confirmed in HEK293 cell culture supernatants, and FGF23 was reduced. The analysis of FGF23 glycan modification prior to decomposition, the introduction of FGF23 into HEK293 cells by acid substitution at the cleavage site of FGF23 molecule, and the introduction of FGF23 into HEK293 cells. The molecular structure of FGF23 was analyzed and confirmed. The molecular structure is modified by the sugar chain. In addition, the sugar lock modification site was analyzed, and the T178 residue was replaced by R176Q T178A variant FGF23 residue. The same analysis was performed, and the sugar lock modification site was analyzed, and the multiple residue was disappeared. The original FGF23 residue was confirmed. The results showed that HEK293 cells were modified by FGF23 at T178, and the modified by FGF23 at T178 was modified by FGF23 at T178. Comparative analysis of wild-type FGF23, R176Q, T178A and variant FGF23; Glycolocking modification of T178 is important for molecular stability of FGF23; Glycolocking modification of GALNT3 is important for molecular stability of FGF23.