ムチン型糖鎖糖転移酵素欠損患者にみられる家族性腫瘍性石灰化沈着症の発症機構

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本研究ではGALNT3変異による家族性腫瘍性石灰化沈着症発症機構を解明するため、FGF23の糖鎖修飾に着目した。前年度で解析したGALNT3の発現とFGF23の分子安定性の関連をさらに解析するため、Po1 II系プロモーターを持つRNAi発現ベクターを用いてGALNT3を含む複数のGALNTアイソフォームに対して特異的RNAiコンストラクトを作製しHEK293細胞に一過性あるいは恒常的に発現させた。このRNAi発現細胞にC末端にV5およびHisタグ配列を付加したFGF23をHEK293細胞に一過性に発現させた。解析の結果、GALNT3を特異的に抑制したHEK293細胞で培養上清中のFGF23分子の顕著な減少を確認した。次に分解前の状態のFGF23の糖鎖修飾を解析するため、FGF23分子のプロテアーゼ切断部位をアミノ酸置換したR176QおよびR179Q変異型FGF23をHEK293細胞に導入した。ウェスタンブロット解析から、完全長FGF23の分子サイズに複数のバンドを確認した。分子サイズの変化は糖鎖修飾によるものと考えられた。さらに、糖鎖修飾部位を解析するため、プロテアーゼ切断部位にあるT178スレオニン残基をアラニンに置換したR176Q T178A変異型FGF23コンストラクトを作製し同様に解析したところ、糖鎖修飾による複数のバンドは消失し、1本の完全長FGF23を示すバンドのみを確認した。この結果から、HEK293細胞においてFGF23のムチン型糖鎖修飾部位はT178であり、この部位のムチン型糖鎖修飾にバリエーションがあることが明らかとなった。野生型FGF23とR176Q T178A変異型FGF23の比較解析から、T178への糖鎖修飾はFGF23の分子安定性に重要であり、GALNT3はその部位への糖鎖修飾によりFGF23の分子安定性に寄与していると考えられた。