SHRにおけるインスリン抵抗性遺伝子KAT-1の過剰発現及び欠損マウスによる解析

使用 SHR 中胰岛素抵抗基因 KAT-1 的过表达和缺失小鼠进行分析

• 批准号: 18790612
• 负责人: 飯塚 陽子
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790612/
• 关键词: インスリン抵抗性; 遺伝子導入; SHR(高血圧自然発症ラット); 高血圧; 交感神経活動亢; 延髄吻側腹外側野(RVLM); telemetryシステム; インスリン感受性; 交感神経活動亢進

【目的】メタボリックシンドロームのモデル動物である高血圧自然発症ラット(SHR)の3番染色体には血圧と体重、脂肪細胞でのインスリン抵抗性と脂肪分解障害に連鎖するQTL(quantitative trait locus)が集簇し、われわれはその原因候補遺伝子としてKAT-1(kynurenine aminotransferase-1遺伝子)を同定し、SHRのKAT-1には機能的変異(E61G)が存在することを報告してきた。本研究では、ジーンターゲティング法を用いてKAT-1ノックアウトマウスの作製を目指し、その解析を通じて、SHRにおけるインスリン抵抗性原因候補遺伝子としてのKAT-1の果たす役割を明らかにすることが目的である。【方法】ES細胞を用いたジーンターゲティングの常法に従い実験を行った。マウスのKAT-1遺伝子全長を含むP1ファージクローンを単離し、そのゲノム遺伝子の構造解析を行った。マウスKAT-1遺伝子は13個のエクソンよりなり、エクソン5-7に活性に重要なドメインが集中しているため、この領域の欠失を狙ったターゲティングベクター構築を進めた。また、SHRにおいてE61Gミスセンス変異がヤウスのエクソン2に存在しているため、翻訳開始点、E61Gも含めた領域の欠損を狙ったターゲティングベクターの構築も行った。ES細胞へのインジェクション、マウス間での交配実験を通じてKAT-1遺伝子欠損マウスを作製した。【成績】1)制限酵素を用いた遺伝子組み換えによりターゲティングベクターを構築し、DNAシークエンシングにより塩基配列を確認した。2)エレクトロポレーション法により、ターゲティングベクターをES細胞に導入し、PCR法及びSouthern blot解析により、全部で25個の陽性クローンが確認された。3)過排卵による採卵、ES細胞へのマイクロインジェクション、子宮内への移植等によりキメラマウスが得ら、現在さらなる交配を通じて、F1マウスの作出を試みている。【結論】ジーンターゲティング法を用いて、KAT-1のキメラマウスが得られた。今後マウス間での交配によりKAT-1のホモ・ヘテロのノックアウトマウスを作製し、高血圧をはじめとするSHRのメタボリックシンドローム様表現型とKAT-1との関連性をin vivoで明らかにする。

【 objective 】 メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム の モ デ ル animal で あ る natural 発 disease high blood 圧 ラ ッ ト (SHR) の three transgressions of chromosome に は blood 圧 と body weight, fat cells で の イ ン ス リ ン resistance と adipose decompose handicap of に chain す る QTL (policy trait Locus) が cluster し, わ れ わ れ は そ の reason alternate heritage 伝 son と し て KAT - 1 (kynurenine aminotransferase - 1 heritage 伝) を with し, SHR の KAT - 1 に は function variations of different (E61G) が す る こ と を report し て き た. This study で は, ジ ー ン タ ー ゲ テ ィ ン を グ method with い て KAT - 1 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を refers the の cropping し, そ の parsing を tong じ て, SHR に お け る イ ン ス リ ン cause of resistance to alternate but 伝 と し て の の KAT - 1 fruit た す "を cut Ming ら か に す る こ と が purpose で あ る. 【 Method 】ES cells を were subjected to った using the を たジ <s:1> タ タ タ <s:1> ゲティ グ グ グ <s:1> を experiment を. Heritage マ ウ ス の KAT - 1 伝 over child を containing む P1 フ ァ ー ジ ク ロ ー ン を 単 し, そ の ゲ ノ ム heritage 伝 son の structure line を っ た. Heritage マ ウ ス KAT - 1 伝 は son 13 の エ ク ソ ン よ り な り, エ ク ソ ン 5-7 に active に important な ド メ イ ン が concentrated し て い る た め, こ の owe lost を の field being っ た タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー build を into め た. ま た, SHR に お い て E61G ミ ス セ ン ス - different が ヤ ウ ス の エ ク ソ ン 2 に exist し て い る た め, 訳 start points, E61G も containing め の owe た field loss を previously っ た タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー の line build も っ た. ES cells へ の イ ン ジ ェ ク シ ョ ン, マ ウ ス between で の mating be 験 を tong じ て KAT - 1 heritage 伝 son owe loss マ ウ ス を cropping し た. Limitations [results] 1) enzyme を with い た heritage 伝 subgroups み in え に よ り タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー を build し, DNA シ ー ク エ ン シ ン グ に よ り salt base with column を confirm し た. 2) エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン method に よ り, タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー を に import し ES cells, the PCR method and び Southern blot parsing に よ り, all で 25 の positive ク ロ ー ン が confirm さ れ た. 3) before ovulation に よ る eggs, ES cells へ の マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン, intrauterine へ の transplantations に よ り キ メ ラ マ ウ ス が ら, now さ ら な る mating を tong じ て, F1 マ ウ ス の try make を み て い る. 【 conclusion 】 ジ ー ン タ ー ゲ テ ィ ン を グ method with い て, KAT - 1 の キ メ ラ マ ウ ス が have ら れ た. Mating between future マ ウ ス で の に よ り KAT - 1 の ホ モ · ヘ テ ロ の ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を as し, high blood 圧 を は じ め と す る SHR の メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム others phenotype と KAT - 1 と の masato even sex を in vivo で Ming ら か に す る.