化学・放射線療法が必要な若年女性患者の卵巣機能温存のための卵巣凍結保存技術の確立

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(1)CASを用いて凍結したマウス卵巣の生殖能力の検討。Green Fluorescent Protein(GFP)を全身に発現するトランスジェニックマウスから卵巣を摘出、凍結する技術を確立した。また、1週間マイナス80度にて保存した後、融解し、野生型レシピエントマウスへ他家移植する技術もほぼ確立した。(2)CASを用いて凍結したマウス卵子、顆粒膜細胞、莢膜細胞の細胞膜の形態的変化の検討。CASを用いて凍結・融解した卵巣を透過型電子顕微鏡で観察する方法を検討中である。(3)CASを用いて凍結・融解したマウス卵子のアクチン細胞骨格と微小管の観察。CASを用いて凍結・融解した卵巣の切片を4%パラホルムアルデヒドで固定し、ファロイディンでアクチンを染色し、コンフォーカル顕微鏡で観察した。凍結していないコントロールの卵巣と今のところ細胞骨格に違いを認めず、凍結の細胞骨格への影響は少ないと考えている。(4)CASで凍結したマウス卵巣から顆粒膜細胞の分離、初代培養。レシピエントマウスを過排卵処理したのち、屠殺、開腹し、卵管より顆粒膜細胞と卵を回収し、ピペットで顆粒膜細胞と卵を分離した後、遠心分離して顆粒膜細胞のみを回収することに成功した。今後はフローサイトメトリーでGFPが蛍光された顆粒膜細胞のみを回収し、血清を添加した培養液で初代培養する。すなわち、CASで凍結した顆粒膜細胞のみを回収する技術を確立中である。