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象牙質リンタンパク質の成熟化機構の解明と象牙質再生療法への応用

牙本质磷蛋白成熟机制的阐明及其在牙本质再生治疗中的应用

基本信息

批准号：
18791407
负责人：
安田善之
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18791407/
关键词：
象牙質再生歯髄細胞プロテアーゼ

项目摘要

ヒト歯髄細胞の培養とヒト象牙質シアロリンタンパク質のクローニングを行うため、矯正理由により便宜抜去された歯牙から無菌的に歯髄組織を取り出し、0.1%コラゲナーゼ処理後ディッシュに播種し、4〜8継代後の歯髄細胞を得た。アスコルビン酸とβ-グリセロリン酸で1週間処理された歯髄細胞よりDNAを調整し、PCR法によりヒト象牙質シアロリンタンパク質の全長遺伝子の増幅を試みたが、発現量が少なく成功しなかった。次に、初代培養ラット歯髄細胞を調製し象牙質シアロリンタンパク質の全長遺伝子の増幅を行ったところ、象牙質シアロタンパク質と象牙質リンタンパク質の各々の遺伝子断片が得られた。さらに、象牙質シアロリンタンパク質発現ベクターの構築および安定発現株の確立を目指した。しかし、C末端にHis tagを有する哺乳類細胞発現ベクター(pGC dual vector)への象牙質シアロリンタンパク質のサブクローニングに成功しなかったので、N末端にGST tagを持つ大腸菌発現用ベクターにサブクローニングした。シークエンスにより遺伝子配列を確認したが変異や欠損は見られず問題なかった。作製されたプラスミドをBL21にトランスフォーメンションし、Glutathione Sepharoseにてリコンビナントタンパク質を精製した。象牙質シアロリンタンパク質の成熟化において機能するプロテアーゼを同定するため、ラット歯髄細胞の抽出液画分によるリコンビナント象牙質シアロリンタンパク質のプロセシングを解析したところ、MMPインヒビターにより顕著な抑制が見られた。さらに、精製MMP-2により同様のプロセシングが確認できた。以上の結果から、象牙質形成においてはMMPが重要な役割を担っていることが示唆された。

The culture of dental cells and the quality of dental tissue were studied. The dental cells were obtained after 4 ~ 8 generations of treatment with 0.1% solution. The DNA of human dental cells was regulated by β-glucuronic acid treatment for 1 week, and the amplification of full-length DNA of human dental cells by PCR was tested successfully. In addition, primary culture cells were modulated to obtain the full length gene fragments of dentin, dentin and dentin. In addition, the establishment of dentin and its stability is indicated in the construction of dentin and its stability. Mammalian cells with His tag at the C-terminal end of the pGC dual-vector are successful in developing dentine proteins from the pGC dual-vector to the pGC dual-vector. The problem of the problem is that the problem of the problem is not solved. The quality of the product is refined according to BL21, Glutathione Sepharose, and the quality of the product is refined. Dentine maturation function is the same as that of dentin maturation. Dentine cell extracts are analyzed and MMP is inhibited. In addition, MMP-2 was purified and identified as the same protein. As a result, dentin formation is important for MMP development.