象牙質リンタンパク質の成熟化機構の解明と象牙質再生療法への応用

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ヒト歯髄細胞の培養とヒト象牙質シアロリンタンパク質のクローニングを行うため、矯正理由により便宜抜去された歯牙から無菌的に歯髄組織を取り出し、0.1%コラゲナーゼ処理後ディッシュに播種し、4〜8継代後の歯髄細胞を得た。アスコルビン酸とβ-グリセロリン酸で1週間処理された歯髄細胞よりDNAを調整し、PCR法によりヒト象牙質シアロリンタンパク質の全長遺伝子の増幅を試みたが、発現量が少なく成功しなかった。次に、初代培養ラット歯髄細胞を調製し象牙質シアロリンタンパク質の全長遺伝子の増幅を行ったところ、象牙質シアロタンパク質と象牙質リンタンパク質の各々の遺伝子断片が得られた。さらに、象牙質シアロリンタンパク質発現ベクターの構築および安定発現株の確立を目指した。しかし、C末端にHis tagを有する哺乳類細胞発現ベクター(pGC dual vector)への象牙質シアロリンタンパク質のサブクローニングに成功しなかったので、N末端にGST tagを持つ大腸菌発現用ベクターにサブクローニングした。シークエンスにより遺伝子配列を確認したが変異や欠損は見られず問題なかった。作製されたプラスミドをBL21にトランスフォーメンションし、Glutathione Sepharoseにてリコンビナントタンパク質を精製した。象牙質シアロリンタンパク質の成熟化において機能するプロテアーゼを同定するため、ラット歯髄細胞の抽出液画分によるリコンビナント象牙質シアロリンタンパク質のプロセシングを解析したところ、MMPインヒビターにより顕著な抑制が見られた。さらに、精製MMP-2により同様のプロセシングが確認できた。以上の結果から、象牙質形成においてはMMPが重要な役割を担っていることが示唆された。