羊膜を用いて三次元培養皮膚を作り及び臨床応用

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本研究の具体的な目的は、羊膜を応用することにより、簡便かつ大量作製可能な三次元培養皮膚作成法を確立することである。簡便な方法を確立することができれば、当然大量作製法につながると予想される。昨年度従来の三次元培養皮膚作製方法を改良し、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に羊膜を密着させ、その上に角化細胞を播種し空気曝露にて重層化させる方法で形態的に優れた三次元培養皮膚を作製する方法を開発した。しかし、コラーゲンゲル作製は非常に複雑であり、作製に時間と手間がかかる。そこで、ゲルを用いないで三次元培養皮膚が作製できないかについて検討した。カルチャーインサートに直接線維芽細胞を播種し、羊膜をカバーしその上に角化細胞を播種し同様に空気曝露にて重層化させた。経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて検索した。HE染色所見ではゲルなし羊膜付き三次元皮膚においても基底細胞は整然と配列し、有棘層の細胞も均一で、形態的に非常に優れた培養皮膚が作製できた。免疫染色にて基底膜構成成分、細胞間接着因子、細胞骨格、分化マーカーなどの発現を比較したところ、基底膜の成分は線状に均一に発現しており、正常皮膚により近い発現様式であった。電子顕微鏡検査ではヘミデスモゾームは発達しており、基底板、稽留繊維も非常にしっかりとしていた。以上の結果より、羊膜を併用することでゲル作製不要の簡易三次元培養皮膚作製法を開発した。