レンチウイルスベクターとsh・RNAを用いたノックダウンマウスの作製

使用慢病毒载体和 sh RNA 产生敲除小鼠

• 批准号: 18659325
• 负责人: 橋本 公二
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659325/
• 关键词: Toll-like receptor; sh-RNA; レンチウィルスベクター; ノックダウン; トランスジェニックマウス; TLR2; TLR3; 角化細胞

本研究の目的は、sh-RNA法とレンチウイルスベクターの技術を融合したノックダウンマウスの作製法を樹立することである。この技術が確立されれば低コストで短時間に多くの遺伝子の機能が抑制されたマウスを作製することが可能となり、皮膚科領域のみならず、生物、医学研究の発展に大きな貢献ができるのではないかと考えられる。具体的には、プロトタイプモデルとしてToll-like recptor(TLR)アイソタイプを同時に抑制するトランスジェニックマウスを作成する。TLR2,TLR3の発現を効果的に抑制できるsh-RNAを作製し、レンチウィルスベクターに組み込んだ。このウィルスベクターを角化細胞に導入し、抑制効果を確認した。生後1日の新生児マウス背部皮膚を剥離切除しディスパーゼ処理、続いてトリプシン処理を行い、低カルシウム無血清培地をもちいて表皮細胞を培養した。レンチウイルスベクターをMOI20にて感染し48h後にtotal RNAを回収した。標的配列を持つウイルスの効果をコントロールスクランブル配列と比較してABI prismを用いてreal-time PCRを行った。TLR2,TLR3のリガンド刺激においてシグナル伝達は抑制されていた。レンチウイルスベクターのpLe-U6iのU6 promoterとsh-RNA配列の間にバクテリオファージ由来のloxP配列、終止配列(TTTTTT)、loxP配列をタンデムにつないだスタッファーを挿入しsilent-lentivirus vector(U6LSL-shRNA,LSL=loxP-stop-loxP)を作製した。このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製する準備までは完了したが、実際のマウス作製には至らなかった。

The purpose of this study is to establish a new method for the synthesis of RNA from RNA. This technology has been established in the field of dermatology, biology and medical research, and has made great contributions to the development of dermatology, biology and medicine. The Toll-like receptor (TLR) can be activated at the same time. TLR2, TLR3 gene expression is inhibited by sh-RNA. The introduction of keratinized cells and the inhibition of keratinized cells were confirmed. 1 day after birth, the skin on the back of the newborn was peeled off, treated with high temperature, cultured in serum-free medium. The total RNA was recovered after 48 h of infection at MOI20. The target alignment is based on real-time PCR. TLR2, TLR3 and TLR3 are stimulated and inhibited. The U6 promoter and sh-RNA alignment of pLe-U6i and loxP are controlled by a silent-lentivirus vector(U6LSL-shRNA,LSL=loxP-stop-loxP). This is the first time I've ever been in a situation where I've been in a situation

项目成果

TAK1 is essential for differentiation and the prevention of apoptosis in epidermis.

TAK1 对于表皮分化和预防细胞凋亡至关重要。

• 发表时间: 2006
• 期刊: The Journal of Biological Chemistry 281
• 作者: Sayama K;Hanakawa Y;Nagai H;Shirakata Y. et al.
• 通讯作者: Shirakata Y. et al.

Milroy's disease: a case report of the congenital lymphedema pedigree

米尔罗伊氏病：先天性淋巴水肿家系一例报告

• 发表时间: 2007
• 作者: Hirakawa S;Murakaami S;Hashimoto K
• 通讯作者: Hashimoto K

Pre-B-cell leukemia transcription factor 1 is a major target of promyelocytic leukemia zinc-finger-mediated melanoma cell growth suppression

• DOI: 10.1038/sj.onc.1209800
• 发表时间: 2007-01-01
• 期刊: ONCOGENE
• 影响因子: 8
• 作者: Shiraishi, K.;Yamasaki, K.;Higashiyama, S.
• 通讯作者: Higashiyama, S.

A novel function of angiotensin II in skin wound healing.

血管紧张素 II 在皮肤伤口愈合中的新功能。

• 发表时间: 2006
• 期刊: The Journal of Biological Chemistry 281
• 作者: Yahata Y;Shirakata Y. et al.
• 通讯作者: Shirakata Y. et al.

CXCL16 is a novel mediator of the innate immunity of epidermal keratinocytes.

• DOI: 10.1093/intimm/dxm083
• 发表时间: 2007-09
• 期刊: International immunology
• 影响因子: 4.4
• 作者: M. Tohyama;K. Sayama;H. Komatsuzawa;Y. Hanakawa;Y. Shirakata;X. Dai;Lujun Yang;S. Tokumaru;H. Nagai;S. Hirakawa;M. Sugai;K. Hashimoto