細胞シート工学を用いたヒト間葉系幹細胞の3次元培養とその分化誘導

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ヒト子宮内膜由来間葉系幹細胞を温度応答性培養皿に播種・培養し、温度低下処理により細胞シートを回収した。回収した細胞シートを積層化し、培養皿上に接着させた状態で培養した。グルコース・乳酸など培地内の代謝成分、細胞存率および薄切切片を経時的に解析し比較を行った。積層枚数の違いによる積層化細胞シートの状態の変化から、培養可能な組織の厚みは40μmであった。これは、組織が厚くなると拡散の限界により、低酸素・栄養不足・老廃物の蓄積等が生じることが原因だと考えられる。拡散の限界を克服する方法として、組織の上下両側を培養液に接触させる培養法やラット背部皮下組織への3層積層化細胞シートの繰返し移植を行ったところ、100μm以上の厚い組織が作製可能であることを確認した。次に、培養した積層化細胞シートの薄切切片を作製し、経時的に幹細胞マーカーを用いて染色した。その結果、培養日数により組織の一部が幹細胞マーカーに陰性となることが分かった。これは、3次元組織中で間葉系幹細胞が何らかの細胞に分化したことを示唆している。また、培養1日目の特に40μm以上の厚い組織の中層部において、軟骨細胞様の細胞が認められ、軟骨特殊染色および軟骨特異的マーカーによる免疫染色において陽性であった。以上のように本年度は、細胞シート工学の手法により、間葉系幹細胞を用いてin vitroで3次元組織を構築することに成功し、その厚さの限界を明らかにした。そして、3次元培養において間葉系幹細胞が軟骨細胞に分化することを確認し、3次元組織内では環境に応じて部位により分化の相違が生じる可能性を示唆する結果が得られた。