ショウジョウバエ遺伝学とケミカルジェネティクスを融合した創薬研究

结合果蝇遗传学和化学遗传学的药物发现研究

基本信息

批准号：
12J10869
负责人：
川口充康
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

当初はショウジョウバエに幼虫にケミカルライブラリーの化合物が入ったエサを食べさせ、スクリーニングを実施する予定であったが、96-well plateを用いて幼虫にエサを食べさせ安定して成虫まで成長させるとことが、想像していたより遥かに難しいことが分かった。エサの組成、水分等検討の余地はあるが、容易ではないと考えた。そこで、ショウジョウバエ研究において汎用されるgene switchの系を用いて、ケミカルスクリーニング系の構築を図った。Gene switchとはRU486のような薬剤を好きなタイミングで処理することで、特定のプロモーター活性を"ON"にするような系である。具体的には、全身で発現誘導をかけられるTubulin genes witchを用いてショウジョウバエTNF-αであるEigerを発現誘導することとした(Tub^<GS> Eiger)。この系統のハエのwing discを解剖して取り出し、96-well plateを用いたdisccultureの系にて培養し、RU486で細胞死を誘導した。すると、RU486処理によりwing discに細胞死が誘導されPl-positiveとなるとともにwing discの崩壊が見られた。Eigerによって誘導される細胞死はJNK依存的、カスパーゼ非依存的な細胞死であると考えられている。従って、JNK阻害剤を用いて誘導された細胞死を抑制しようとしたが、細胞死を止めることが出来なかった。また、カスパーゼ阻害剤zVADを含めて様々な経路の阻害剤、NACなどの還元剤を添加したが同様に細胞死は止まらなかった。以上の検討から、Eigerによって誘導される細胞死を止めるポジティブコントロールとなる有機小分子化合物が見つけられなかった。VivoとvitroでのEigerの細胞死経路が異なるのかもしれない。

最初，果蝇计划用含有化学库化合物的诱饵喂养幼虫并进行筛选，但发现它比我想象的要困难得多，用96孔板喂养幼虫，并允许它们稳定地生长到成年人。尽管还有一些食物的成分和水分的空间，但我们认为这并不容易。因此，我们尝试使用基因开关系统构建化学筛查系统，该系统通常用于果蝇研究中。基因开关是一个系统，在您选择的任何时候，通过处理RU486等药物来打开特定的启动子活动。具体而言，我们决定使用小管蛋白基因巫婆诱导Eiger（果蝇TNF-α）的表达，该巫婆在整个体内诱导（tub^<gs> eiger）。使用96孔板在饮食系统中剖析，去除该系的蝇盘，去除，培养，并用RU486诱导细胞死亡。然后，通过用RU486处理在机翼盘中诱导细胞死亡，从而导致机翼盘的PL阳性破坏。 Eiger诱导的细胞死亡被认为是JNK依赖性的，与caspase无关的细胞死亡。因此，尽管使用JNK抑制剂来抑制诱导的细胞死亡，但无法阻止细胞死亡。此外，增加了各种途径的抑制剂，包括caspase抑制剂ZVAD和还原剂（例如NAC），但细胞死亡并未停止。从上述研究中，没有发现有机小分子化合物可以用作阳性对照，以阻止Eiger诱导的细胞死亡。 Eiger在体内和体外的细胞死亡途径可能有所不同。