新規蛋白質濃度感受性蛍光蛋白質を用いた分化と蛋白質濃度の関係の解明

使用新型蛋白质浓度敏感荧光蛋白阐明分化与蛋白质浓度之间的关系

• 批准号: 14J01600
• 负责人: 森川 高光
• 金额: $ 1.39万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J01600/
• 关键词: 蛍光蛋白質

①蛋白質混雑と未分化維持、分化の関係の解明はじめに、GimRETを定常発現するES細胞の確立を試みた。作製にはレンチウイルスを用いることにした。しかし、GimRETを定常発現するES細胞は、培養開始後2週間でGimRETを発現しなくなった。これは、ES細胞では、遺伝子のサイレンシングが起こりやすいためであると考えられる。そのため、GimRETを一過性発現したES細胞をサンプルとして用いることにした。蛋白質混雑ごとにES細胞を分け、遺伝子発現を調べた。フローサイトメーターを用いて、蛋白質混雑が高い、低いで分けたES細胞の遺伝子発現を、RT-PCRを用いて調べた。結果、GimRETの蛍光強度比の高い細胞、低い細胞の間に、未分化維持に関係する遺伝子発現の差は見られなかった。②分化によるクロマチン構造の変化の検出インキュベータ付き二光子顕微鏡は、理化学研究所生命システム研究センター先端バイオイメージング研究チームにおいて、オリンパスとの共同開発により開発されたものを用いることにした。インキュベータ付き2光子顕微鏡を用いることで、GimRETを発現させたES細胞を96時間以上観察することに成功した。GimRET－H2Bを定常発現するES細胞の作製を試みたが、上記理由で、一過性発現を用いることにした。GimRET-H2Bが機能することを確認するために、一過性発現用のプラスミドを構築した。そちらをES細胞に遺伝子導入してみると、核内に局在しなかった。

① Protein mixing 雑と undifferentiated maintenance, differentiation <s:1> relationship <e:1> clarification じめに じめに, GimRETを regular presence するES cell <e:1> establishment を test みた. To make に, レ, レ, チウ, スを スを use the に, る, とに, た, た. <s:1> を する, GimRETを regularly present するES cells <e:1>, でGimRETを present なくなった 2 weeks after the start of culture. こ れ は, ES cells で は, but 伝 の サ イ レ ン シ ン グ が up こ り や す い た め で あ る と exam え ら れ る. そ の た め, GimRET を transient 発 now し た ES cells を サ ン プ ル と し て in い る こ と に し た. Proteins are mixed with 雑ごとにES, and the を cells are divided into け and 伝 cells exhibit を regulation べた. フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー を with い て, protein mixed 雑 が high い, low い で points け た ES cells の heritage 伝 発 を now, rt-pcr を with い て adjustable べ た. Results, GimRET の 蛍 light intensity is higher than の, low い い cells between の に, undifferentiated maintain に masato is す る heritage 伝 son 発 is の poor は see ら れ な か っ た. (2) differentiation に よ る ク ロ マ チ の ン structure - the の 検 out イ ン キ ュ ベ ー タ pay き two photon 顕 micromirror は, riken institute life シ ス テ ム research セ ン タ ー apex バ イ オ イ メ ー ジ ン グ research チ ー ム に お い て, オ リ ン パ ス と の common open 発 に よ り open 発 さ れ た も の を with い る こ と に し た. イ ン キ ュ ベ ー タ き two photon 顕 micro mirror を pay い る こ と で, GimRET を 発 now さ せ た ES cells more than 96 time を 観 examine す る こ と に successful し た. GimRET - H2B を constant 発 now す る を try the ES cells の cropping み た が, written reason で, transient 発 を now use い る こ と に し た. The が function of GimRET-H2B する とを とを confirms するために and transient occurrence is constructed by <s:1> プラス ドを ドを ドを. The に remains of そちらをES cells are introduced into the <s:1> てみると, and the に in the nucleus is localized in the な な った った.

项目成果

Glycine-inserted mutant Forster resonance energy transfer (FRET) fluorescent protein to evaluate intracellular crowding

插入甘氨酸的突变体福斯特共振能量转移 (FRET) 荧光蛋白用于评估细胞内拥挤

• 发表时间: 2014
• 作者: Morikawa T;Machiyama H;Okamoto K;Yoshizawa K;Fujita H;Ichimura T;Imada K;Nagai T;Yanagida T;Watanabe T
• 通讯作者: Watanabe T