新規蛋白質濃度感受性蛍光蛋白質を用いた分化と蛋白質濃度の関係の解明

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①蛋白質混雑と未分化維持、分化の関係の解明はじめに、GimRETを定常発現するES細胞の確立を試みた。作製にはレンチウイルスを用いることにした。しかし、GimRETを定常発現するES細胞は、培養開始後2週間でGimRETを発現しなくなった。これは、ES細胞では、遺伝子のサイレンシングが起こりやすいためであると考えられる。そのため、GimRETを一過性発現したES細胞をサンプルとして用いることにした。蛋白質混雑ごとにES細胞を分け、遺伝子発現を調べた。フローサイトメーターを用いて、蛋白質混雑が高い、低いで分けたES細胞の遺伝子発現を、RT-PCRを用いて調べた。結果、GimRETの蛍光強度比の高い細胞、低い細胞の間に、未分化維持に関係する遺伝子発現の差は見られなかった。②分化によるクロマチン構造の変化の検出インキュベータ付き二光子顕微鏡は、理化学研究所生命システム研究センター先端バイオイメージング研究チームにおいて、オリンパスとの共同開発により開発されたものを用いることにした。インキュベータ付き2光子顕微鏡を用いることで、GimRETを発現させたES細胞を96時間以上観察することに成功した。GimRET－H2Bを定常発現するES細胞の作製を試みたが、上記理由で、一過性発現を用いることにした。GimRET-H2Bが機能することを確認するために、一過性発現用のプラスミドを構築した。そちらをES細胞に遺伝子導入してみると、核内に局在しなかった。