未利用資源からの高効率ブタノール生産を目指した学際的研究の実現と推進

实现和促进跨学科研究，旨在利用未利用的资源高效生产丁醇

基本信息

批准号：
14J02694
负责人：
野口拓也
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

微生物発酵プロセスにおいて、グルコースの存在によってキシロースといった他の糖の消費が抑制される事象をカーボンカタボライト抑制（CCR）と呼ぶ。我々はこれまでの研究でセロビオース/キシロース混合糖がCCRを回避したブタノール発酵を可能にすることを明らかにした。したがって当該年度は【CCR回避時の糖輸送および代謝メカニズムの解明と高効率キシロース代謝株創出】を目的として研究を行った。まず、CCR、非CCR条件間で発現量が異なる遺伝子を探索するためにRT-PCRを行った。その結果、ヒスチジン含有リン酸転移タンパク質（HPr）キナーゼ（HPrK）をコードする遺伝子（hprK）の発現量に顕著な差が見られた。そこで、hprKと以前の酵素活性測定試験でCCR、非CCR条件間で3倍活性に差が見られたキシロースイソメラーゼ遺伝子（xylA）について、Real time RT-PCRによる定量解析を行った。実験の結果、非CCR条件下のhprK発現量はCCR条件と比較して45%低下していることが明らかとなった。一方、xylAは10%程度発現量が増加していた。HPrKはCCR機構において中心的な役割を果たす酵素であり、したがってセロビオース/キシロース混合糖利用時のCCR回避はhprK発現量の低下が主な要因であることが示唆された。次に、CCR、非CCR時の細胞内中間代謝物の動態を明らかにするために、メタボローム解析を行った。CCR条件下の代謝物量を1として比較した結果、キシロース代謝を担うペントースリン酸経路（PPP）の代謝物量は条件間で顕著な差は見られなかった。これはPPPが可逆反応であり、解糖系の中間代謝物と共役しているためであると考えられる。したがって、CCR条件下ではキシロース輸送および上流経路（キシロース→キシルロース→PPP）に律速段階が存在するということが示唆された。

在微生物发酵过程中，葡萄糖存在抑制其他糖的消耗的事件（例如木糖）称为碳分解代谢物抑制（CCR）。我们在先前的研究中表明，纤维二糖/木糖混合糖可以进行CCR蒸发的丁醇发酵。因此，在本财政年度，进行研究的目的是阐明在避免CCR期间糖运输和代谢的机制，并创造高效的Xylose代谢菌株。首先，进行RT-PCR以搜索CCR和非CCR条件之间具有不同表达水平的基因。结果，编码含有组氨酸的转磷酸蛋白（HPR）激酶（HPRK）的基因（HPRK）的表达水平存在显着差异。因此，使用实时RT-PCR对木糖异构酶基因（XYLA）进行定量分析，在先前的酶活性测量测试中，CCR和非CCR条件之间的活性差异为3倍。实验表明，与CCR条件相比，非CCR条件下的HPRK表达水平降低了45％。另一方面，Xyla的表达水平增加了约10％。 HPRK是一种在CCR机制中起着核心作用的酶，因此建议避免使用纤维素/木糖混合糖时避免CCR的主要因素是HPRK表达水平的降低。接下来，进行代谢组学分析以阐明在CCR和非CCR期间细胞内代谢物的动力学。当比较CCR条件下的代谢产物的量为1时，在条件下，磷酸五磷酸途径（PPP）中代谢物的量没有显着差异。这被认为是因为PPP是一种可逆的反应，并与糖酵解的中间代谢物结合在一起。因此，建议在CCR条件下的木糖转运和上游途径（木糖 - > xylosose-> ppp）中存在一个限制步骤。