非線形光散乱顕微鏡を用いた生細胞内のタンパク質構造動態の解明

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当該年度は、前年度と同じく、光第二高調波(SHG)顕微鏡による、微小管構造解析の手法を用い、以下のとおり、微小管の構造多形の判別実験を行った。（１）再構成系での微小管束作成法を改良し、微小管構造解析結果の再現性を確かめる。前年度の微小管束作成法では、作成後の微小管に、卵抽出液由来の、多量の微小管結合タンパク(MTOC)が結合しており、MTOCが微小管の構造変化に与える影響が無視できないという問題が残された。そこで、当年度では微小管束作成途中に、MTOCを取り除く過程を加えた。SHG顕微鏡による実験では、前年度と同じGDP型微小管、およびGDP-taxol型微小管の偏光依存性測定から、微小管のSHG特性を表す2つのテンソル成分d31、d33の比d31/d33を解析し、比較した。その結果、GDP型、GDP-taxol型ともに、前年度と有意差の無い結果が得られ、MTOCによる構造変化の懸念は払拭された。（２）多種のヌクレオチド状態の微小管構造観察前述のGDP型、GDP-taxol型に加え、GTPのアナログであるGTP-γS型の測定を行った結果、d31/d33値は、GDP型と有意差が無い結果となった。このことから、GTP型からGDP型への構造遷移において、チューブリン二量体のもつ分極の傾きは変化していないことが示唆される。次に、キネシンの結合したGDP型微小管、および同GDP-taxol型微小管についても測定を行い、キネシン非結合のGDP型、GDP-taxol型との比較を行ったところ、キネシン結合型ではd31/d33値が大きく上昇した。d31/d33値から換算した、チューブリン分極角の大きさは、キネシン非結合GDP型、GDP-taxol型、キネシン結合GDP型、GDP-taxol型でそれぞれ38.47度、39.71度、41.19度、41.64度となった。