カイコにおける条件付き遺伝子ノックアウト法の開発

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カイコの中部絹糸腺を有用タンパク質生産を行う器官として最適化するため、内在性のセリシンタンパク質の発現を外部からコントロールできるカイコ系統の作出を目的としている。2年目は、初年度にクローニングを行ったヒートショックプロモーターに制御されるTALEN遺伝子をカイコゲノムへ導入し、体色マーカー遺伝子の破壊を誘導するための条件検討を行うとともに、本来の目的であるSer1遺伝子を破壊するTALENをカイコに導入するためのベクターを調製した。幼虫の体色を制御するBmBLOS2遺伝子をターゲットとする1対のTALEN遺伝子をそれぞれ異なる蛍光マーカー遺伝子GFPおよびDsRed遺伝子を持つpiggyBacベクターに組み込み、各3系統以上の組換えカイコを作出した。これらを休眠系統と交配し、保存するとともに、異なるTALENを持つ系統同士を交配し、11蛾区の受精卵を採取した。これら11種類の受精卵について、孵化のおよそ3日前（点青期）に42℃に2時間置くことによりTALEN遺伝子の発現を誘導した。5齢期に幼虫体色を観察したところ、油蚕形質の発現は認められなかった。次に、ヒートショックによる発現誘導の時期を産卵翌日とし、6蛾区について同様の試験を行ったところ、すべての蛾区でモザイク状の油蚕形質が確認された。TALEN遺伝子を片方のみ持つか全く持たない個体については、すべて野生型の形質であった。モザイクの程度は系統および個体によって異なり、遺伝子の挿入部位によってTALEN発現の強さが異なることが示唆された。体色マーカー遺伝子により条件付きの遺伝子のノックアウトが確認されたため、初年度に最も効率よくSer1遺伝子を破壊することが確認されたTALEN遺伝子を組み込んだpiggyBacベクターを作製し、カイコ受精卵に注入した。