組織標本上での遺伝子特定部位のメチル化シトシンin situ検出法の開発

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単一の受精卵に由来しながら、神経細胞から皮膚に至る多種多様な組織細胞分化が起こるメカニズムには。エピジェネティクス制御が重要とされている。メチル化シトシンは、エピジェネティクス制御機構の主体をなすDNA修飾であり、組織細胞分化や再生医療のみならず、腫瘍発生・進展においても重要である。特に、癌の個性に応じた薬物療法として、近年ではDNAメチル化阻害剤の適応について検索する手法が重要となる。私どもは、対象遺伝子の調節領域に存在するCpG-islandのシトシンメチル化を、細胞や組織の形態を維持したまま、in situで検出する組織化学的方法の開発についての検討を行った。本年度は、部位特異的DNAメチル化に対して、メチル化シトシンとオスミウム酸により錯体形成するICONプローブ(bipyridine-adenine標識プローブ)に着目し、染色体上で標的DNAとICONプローブとを結合させて、強固な化学結合で固定し、このICONプローブをもとに染色体上でPRINS法を行う実験系を構築することを目指して予検討を行った。染色体上でICONプローブをもとにPCR反応を行う際に、標識化合物を取り込ませた後、標識化合物に対する免疫組織化学にてシグナルを検出する。特異的で高感度のプローブ結合やPCR反応、メチル化シトシン-標識グアニン複合体に対する単クローン抗体の作成が課題となる。本年度は、単クローン抗体作成法の予検討と、染色体標本上でのPRINS法施行についての検討を行った。特に、標本の固定やheat denatureの条件設定や、標本上でのDNA合成進展に最適な酵素試薬の検定などを施行した。効率的なマウス免疫方法や、脾臓リンパ球回収、ミエローマ細胞との細胞融合、HAT培地による選択培養については、最適な実験系を整備することが出来た。