骨形成に関連した転写共役因子CbfbのRunx2による蛋白安定化に関する研究

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Cbfb蛋白のユビキチンプロテアソーム系による蛋白分解機構の解明1).Cbfb蛋白のプロテアソームによる分解の検討各種プロテアーゼインヒビターを作用させた時のCbfb蛋白発現をウェスタンブロッティング法により比較した。Cbfb蛋白を過剰発現させ、4種類(ALLM, ALLN, MG132, Lacta)のプロテアーゼインヒビターで処理し、プロテアソームインヒビター(ALLN, MG132, Lacta)処理群について、コントロール(DMSO)と比較してCbfb蛋白発現を検討した。また、この蛋白を回収した時と同じ条件下でmRNAを回収し、Real time RT-PCRを行い、mRNA発現の比較を行った。2).Cbfb蛋白のユビキチン化の検討Cbfbを過剰発現させて抗タグ抗体で免疫沈降したレーンにおいてポリユビキチンバンドとみられるラダー状のバンドの発現が認められるか検討した。また、これにプロテアソームインヒビターであるMG132を作用させたレーンではさらにポリユビキチンバンドの発現の増加が認められるかについても検討した。3).Cbfb蛋白におけるユビキチン化標的残基の検討ユビキチン化は標的蛋白のリジン残基の修飾が引き金となるという報告がある。そこで、Cbfbにおいて生物種間を越えて高度に保存された5か所のリジン残基に着目し、Cbfb蛋白のユビキチン化において、どのリジン残基が標的になっているのかを検討した。この5か所のリジン残基それぞれに対する変異体を作製した。野生型と変異体を過剰発現させて、蛋白発現を比較する。次に野生型と変異体間でユビキチン他の程度に相違があるかどうかを検討するために、2)と同様の免疫沈降を行った。Runx2によりCbfb蛋白が安定化されるメカニズムの解明細胞株における検討予備検討から、線維系細胞のNIH3T3細胞においてはRunx2を強制発現させた時に内因性Cbfb蛋白発現の上昇が見られないことが確認されている。そこでRunx2, Cbfbを共に強制発現させた際のCbfb蛋白発現の比較をおこなう。Runx2の導入により、量依存的にCbfb蛋白発現が増加するかをウェスタンブロッティング法により検討した。