骨形成に関連した転写共役因子CbfbのRunx2による蛋白安定化に関する研究

Runx2对骨形成相关转录辅因子Cbfb蛋白稳定性的研究

• 批准号: 24792178
• 负责人: 中島 慶治
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-24792178/
• 关键词: 骨形成; Runx2; Cbfb; ユビキチン・プロテアソーム

Cbfb蛋白のユビキチンプロテアソーム系による蛋白分解機構の解明1).Cbfb蛋白のプロテアソームによる分解の検討各種プロテアーゼインヒビターを作用させた時のCbfb蛋白発現をウェスタンブロッティング法により比較した。Cbfb蛋白を過剰発現させ、4種類(ALLM, ALLN, MG132, Lacta)のプロテアーゼインヒビターで処理し、プロテアソームインヒビター(ALLN, MG132, Lacta)処理群について、コントロール(DMSO)と比較してCbfb蛋白発現を検討した。また、この蛋白を回収した時と同じ条件下でmRNAを回収し、Real time RT-PCRを行い、mRNA発現の比較を行った。2).Cbfb蛋白のユビキチン化の検討Cbfbを過剰発現させて抗タグ抗体で免疫沈降したレーンにおいてポリユビキチンバンドとみられるラダー状のバンドの発現が認められるか検討した。また、これにプロテアソームインヒビターであるMG132を作用させたレーンではさらにポリユビキチンバンドの発現の増加が認められるかについても検討した。3).Cbfb蛋白におけるユビキチン化標的残基の検討ユビキチン化は標的蛋白のリジン残基の修飾が引き金となるという報告がある。そこで、Cbfbにおいて生物種間を越えて高度に保存された5か所のリジン残基に着目し、Cbfb蛋白のユビキチン化において、どのリジン残基が標的になっているのかを検討した。この5か所のリジン残基それぞれに対する変異体を作製した。野生型と変異体を過剰発現させて、蛋白発現を比較する。次に野生型と変異体間でユビキチン他の程度に相違があるかどうかを検討するために、2)と同様の免疫沈降を行った。Runx2によりCbfb蛋白が安定化されるメカニズムの解明細胞株における検討予備検討から、線維系細胞のNIH3T3細胞においてはRunx2を強制発現させた時に内因性Cbfb蛋白発現の上昇が見られないことが確認されている。そこでRunx2, Cbfbを共に強制発現させた際のCbfb蛋白発現の比較をおこなう。Runx2の導入により、量依存的にCbfb蛋白発現が増加するかをウェスタンブロッティング法により検討した。

Cbfb protein expression in the protein decomposition mechanism of the Cbfb protein expression system 1).Cbfb protein expression in the protein decomposition system to discuss the role of various Cbfb protein expression in the protein decomposition system. Cbfb protein expression was investigated in four different treatment groups (ALLM, ALLN, MG 132, Lacta) and in comparison with Cbfb protein expression. mRNA expression was compared with real-time RT-PCR under the same conditions. 2) Cbfb protein conversion and detection. The MG132 was used to increase the occurrence of the virus. 3).Cbfb protein target residues identification and modification of target protein residues. Therefore, we have focused on the preservation of five key residues in Cbfb that are highly conserved among biological species, and the key to the conversion of Cbfb proteins. All the residues in the 5-mer sequence are contained in the same sequence. wild-type mutant protein expression The second wild type is different from the other two types. The second wild type is different from the other two types. Runx2 protein stabilizes in cell lines and maintains in NIH 3T3 cells an increase in endogenous Cbfb protein expression when Runx2 is stressed. Comparison of Cbfb protein expression during stress development of Runx2, Cbfb. Runx2 introduction, quantity-dependent Cbfb protein expression increased, and the expression of Cbfb protein increased.