超音波処理によるアミロイド線維形成を指標としたプリオンの新規迅速検出法

以超声波淀粉样原纤维形成为指标的朊病毒快速检测新方法

• 批准号: 25502004
• 负责人: 村山 裕一
• 金额: $ 3.33万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25502004/
• 关键词: 異常プリオン蛋白質; 牛海綿状脳症; アミロイド線維; 超音波処理; チオフラビンT; アミロイド繊維

クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）や牛海綿状脳症（BSE）などのプリオン病の病原体は、高次構造が変化した異常プリオン蛋白質（PrPSc）である。本研究では、超音波処理により、PrPScを核として急速にアミロイド線維が形成される反応を利用し、短時間でかつ高感度にPrPScを検出できる簡便で安全な検出方法を開発する。26年度は、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウス、牛あるいはマウスプリオン蛋白質過発現マウス由来の10%脳乳剤にチオフラビンＴ（ThT, 5μM）を添加し、全自動蛋白質異常凝集インデューサー装置 (Hanabi)を用いて蛍光測定（Ex:445nm, Em:485nm）、超音波処理（15秒照射-1秒休止を5回）、培養（37℃、1時間）の工程を10回繰り返した。また、各脳乳剤を1% Triton Xおよび4 mM EDTAを含むPBSで1:7に希釈したサンプルも同様に解析した。その結果、緩衝液で希釈したプリオン蛋白質過発現マウスの脳乳剤は基質として有効であり、定型BSEおよびL型非定型BSE由来PrPSc（1/1000希釈）の場合、デキストラン硫酸ナトリウム（0.5-1%)を添加することによって、反応開始後２～３時間で急速なThT蛍光の上昇が認められた。27年度は、ウェル間のばらつきを検証し、反応が良好なウェルを選別した。さらに超音波照射を均一化する目的で、X軸方向にウェルを±8 mm振盪した。ウシリコンビナントプリオン蛋白質（25μg/ml）を1% Triton Xおよび4mM EDTAを含むPBSで希釈し、ThTを加えたものを基質として用いた。またポリアニオンやアルギニンを基質に加え、その効果を検討した。その結果、リコンビナントプリオン蛋白質を基質に用いた場合、L型およびH型非定型BSEプリオンの検出が１～３時間で可能になった。

The pathogen of bovine spongiform encephalopathy (BSE) and bovine spongiform encephalopathy (CJD) is a protein with high structural abnormality. In this study, a simple and safe method for detecting PrPSc with high sensitivity in a short time was developed. In 2016, 10% milk agent from the protein gene CKAKAKATMAUU Each emulsion contains 1% Triton X and 4 mM EDTA, and the ratio of Triton X to EDTA is 1:7. As a result, the buffer solution is expected to release protein, and the emulsion matrix is available. In the case of the formation of BSE and L-type non-formation of BSE, PrPSc (1/1000) is added to the buffer solution. The increase of ThT fluorescence is rapid 2 to 3 times after the start of the reaction. In 2007, the company was awarded the title of "Excellent Enterprise". For the purpose of homogenization of ultrasonic irradiation, ±8 mm oscillation is observed in the X axis direction. It contains 1% Triton X and 4mM EDTA. It contains 1% Triton X and 4mM EDTA. The results of the study were as follows: The results show that when the protein matrix is used, the L-type BSE and the H-type BSE may be used for 1~3 times.