メタゲノム及び進化工学的手法によるリグノセルロース系廃棄物の微生物分解

使用宏基因组和进化工程方法对木质纤维素废物进行微生物降解

• 批准号: 08F08619
• 负责人: 宮崎 健太郎
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08F08619/
• 关键词: β-グルコシダーゼ; 進化分子工学; バイオマス; 耐熱化; 機能改変; スクリーニング; β-グルコシターゼ

リグノセルロース系廃棄物は、地球上に最も多く存在する未利用バイオマスであり、食糧とも競合しないことから、その有効利用が求められている。とくに最近ではバイオエタノール製造に関する研究が盛んであり、本研究課題についても、このような時代背景のもと、酵素的に効率分解する方法の開発を目的に行われた。β-グルコシダーゼの由来として、高活性であることが知られている好冷菌由来の酵素を選定した。本酵素は好冷菌由来酵素に特有な高い活性を有する一方、安定性に劣るという欠点を有していた。そこで進化分子工学的手法により、本酵素を耐熱化し、活性が高くかつ安定性に優れた酵素に改変することを目指した。好冷菌酵素としてはすでに報告のあるものを用い、大腸菌での発現を考慮し、コドンを最適化した遺伝子を合成した。実際に、本酵素遺伝子をpETベクターに連結し、大腸菌内で発現させると、低温(20-25℃)では呈色基質の分解により現れる青色コロニーの出現が確認された。だが、37℃では青変せず、高温下では活性を示さないこと、あるいはタンパク質フォールディングがうまくいかないことが判明した。このように、酵素活性の有無を寒天プレート上で簡便にアッセイできることが確認されたため、変異ライブラリーのスクリーニングを寒天培地アッセイで行うこととし、以後の進化工学的実験に移行した。進化実験では、まず変異PCR法により遺伝子にランダム変異を誘起し、野生型では活性を示さない温度でスクリーニングすることで、耐熱化株の選抜を行うこととした。具体的には、37℃あるいはさらに高温の40℃で活性を示す変異体のスクリーニングを行った。その結果、それぞれの温度で数個ずつ、やや青色を帯びたコロニーが得られた。耐熱化を確かめるために、大腸菌内で発現させた組み換え酵素をNi-NTAスピンカラムで簡易精製した。こうして得た酵素の安定性を調べたところ、安定性の向上というよりも、高温での発現量が増していることが示唆された。さらに変異部位を同定するために塩基配列解析を行ったところ、いくつかの変異体はオープンリーディングフレーム内に変異が認められず、疑陽性(ベクター領域に予期せぬ変異が生まれた可能性がある)であり、実際に変異を有するものは一種類のみであった。ただし、これについても同義置換であり、酵素そのものが耐熱化されたわけではないことが明らかとなった。

The most important thing on earth is that there is no use for food, and there is no use for food. Recently, there has been a lot of research on the production of enzymes. The purpose of this research is to develop methods for the analysis of enzymes in the background of the times. The origin of β-glucagon and its high activity are selected. The enzyme has high activity and low stability. The method of evolutionary molecular engineering is used to improve the stability and heat resistance of the enzyme. The expression of E. coli is considered and optimized. In fact, the enzyme gene pET is linked to the protein, and the protein is detected in Escherichia coli at low temperature (20 - 25 ℃). At 37 ℃, the activity was detected. The activity of enzyme is easy to identify, and the activity of enzyme is easy to identify. Evolution is a process for the selection of heat-resistant strains by PCR, which is used to induce gene mutation and wild-type activity. The specific temperature is 37 ℃, the temperature is 40 ℃, and the activity is different. The result is that the temperature of the mixture is several times higher than that of the mixture. Heat resistance is determined by the presence of Ni-NTA enzymes in Escherichia coli, which are easily purified. The stability of the enzyme is regulated, the stability of the enzyme is increased, and the activity of the enzyme at high temperature is increased. In addition, the analysis of the base arrangement of the different parts is carried out in the same way, and the difference between the different parts is recognized in the same way, and the difference between the different parts is suspected in the same way. The heat resistance of the enzyme is very high.