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シェーグレン症候群の発症における分子機構解析

干燥综合征发病的分子机制分析

基本信息

批准号：
08J00077
负责人：
中村友美
金额：
$ 1.15万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

M3Rは4つの細胞外領域を有する受容体であり、唾液・涙液分泌に関与する。口腔および眼における乾燥症状を主体とするシェーグレン症候群患者血清中には、4つの細胞外領域に対する自己抗体が認められており、特に第二細胞外領域に対する自己抗体は細胞内シグナル抑制的な機能を有することを示した。他の自己抗体の存在および抗M3R抗体自体の量的な影響を除外できないため、M3R特異的なモノクローナル抗体を作製と機能解析を検討した。まず最初に、生物活性の中心である第二細胞外領域25mer (M3R_<25>)に対するモノクローナル抗体作製より着手した。M3R_<25>の合成ペプチドと等量のCFAで作製したエマルジョンを6週齢のC57BL/6マウスに2週間毎計3回免疫後、脾臓とマウスミエローマ細胞株を細胞融合し、HAT選択培地でコロニーのピックアップを行った。ELISA法にてスクリーニングし、M3R_<25>特異的なハイブリドーマのみを大量培養し、培養上清から抗M3R_<25>モノクローナル抗体を精製した。細胞融合は2回行い、4つのクローンを得ることができた。抗体のアイソタイプはいずれもIgG2b・Kであった。このモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット法にてヒトリコンビナントM3R蛋白(hrM3R)と結合した。さらに、機能解析の実験として4種類のモノクローナル抗体をHSG細胞と12時間共培養させた後、M3R特異的アゴニストである塩酸セビメリンを添加したときの細胞内カルシウム濃度を蛍光プレートリーダーで測定したところ、すべての抗M3R_<25>モノクローナル抗体において細胞内シグナルを抑制する傾向が認められた。また、4クローンのV領域(CDR3)におけるアミノ酸配列のシークエンスを行ったところ、4クローンのうち3クローンは同一クローンであり、2種類のハイブリドーマ細胞を得たことが判明した。以上のことから、M3R_<25>モノクローナル抗体は、唾液腺組織において唾液分泌を抑制する可能性が考えられた。

In the extracellular domain of M3R, there are receptor receptor, saliva secretion and saliva secretion. The main symptoms of dryness in the oral cavity, the eyes, the main body, the patients with dry symptoms, the patients with dry eyes, the patients with dry symptoms, the His own antibody has an effect on the amount of autoantibody against M3R, except that the anti-M3R antibody can be analyzed by the anti-M3R specific antibody machine. First, bioactive center, second, extracellular domain 25mer (M3RNAs, LTX, 25gt;), antigens (antibodies). After 3 times of immunization in the interval of 2 cycles, the spleen cell lines were fused and HAT was selected. After 3 times of immunization, the cell lines were fused and HAT selected. The anti-M3RNAs were detected by ELISA method, and the antibodies against M3RNAs were detected by Elisa. The cells are fused for 2 cycles and 4 times for each other. The antibody was infected by IgG2b. K antibody. The antibody was detected by Elisa, the antibody was detected by Elisa, and the M3R protein (hrM3R) fusion protein was detected by Elisa. After 12 hours of co-culture of anti-HSG antibodies in the cells of M3R, the M3R-specific cells were incubated for 12 hours, and the M3R special antibodies were incubated for 12 hours. after the cells were co-cultured for 12 hours, the M3R special cells were incubated for 12 hours, and the M3R specific antibodies against M3RNAs were detected. The antibody was not detected in the cell, and the intracellular antibody was inhibited. In the field of information technology (CDR3), information is required to improve the performance of the system. For example, if you are in the same situation, please do not know how to do the same. For example, please do not know how to do the same thing. The possibility of inhibition of saliva secretion in salivary gland tissue was tested by antibody assay, salivary gland tissue test, and so on.