低温誘導性NTR-Cの機能解明に基づく耐凍性植物の作出

基于冷诱导NTR-C功能的阐明培育抗冻植物

基本信息

批准号：
08J02023
负责人：
町田豪
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は下記に示す(1)～(4)の項目について研究を実施した。(1)CvNTRC/CvPrxのタンパク質レベルでの機能解析両組換えタンパク質を0-500mM NaCl含有緩衝液内で反応させ,ゲルろ過クロマトグラフィーによる複合体検出ならびに分子量測定を行った。その結果,両タンパク質が形成する複合体ピークは塩濃度により異なる保持時間で検出された。また,100mM NaCl存在下で過酸化物分解活性が最大となったことから,本抗酸化系が環境条件により複合体形成様式を変化させ,その活性を調節する機能を持つことが示唆された。(2)CvNTRC,CvPrx遺伝子同時発現酵母の作製とストレス耐性試験CvNTRC,CvPrx遺伝子を単独または共発現する酵母を作製し,耐凍性,耐熱性,酸化ストレス耐性試験を行った。その結果,CvNTRCのみを発現,および両遺伝子を共発現する酵母において,全ストレスに対する耐性が増大した。さらに,酸化ストレス誘導剤であるメナジオン存在下で,両遺伝子の発現による超酸化物アニオンの蓄積抑制が観算された。本成果は,植物NTRCが関与する系の耐凍性,耐熱性への効果とin vivoにおける機能を初めて明らかにしたものである。(3)植物用2遺伝子同時発現ベクターの改変pRI101-ANベクターを用い,CaMV35SプロモーターからNOSターミネーターまでの領域をPCRで増幅し,制限酵素を用いてT-DNA領域に導入することで,2つの異なる遺伝子を個別に同時発現できるベクターに改変した。(4)CvNTRC,CvPrxの植物発現用ベクターの構築と形質転換アグロバクテリウムの作製CvNTRC,CvPrxの単独または両方を前項(3)のベクターに組み込み,植物発現コンストラクトを作製した。本コンストラクトをアグロバクテリウムに導入し,コロニーダイレクトPCRにより導入を確認した。今後,本形質転換アグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナの形質転換を行い,本抗酸化系の耐凍性獲得への関与と機能を調べていく。

今年，我们对以下项目（1）至（4）进行了研究。（1）在蛋白质水平上CVNTRC/CVPRX的功能分析两个重组蛋白在含有0-500 mM NaCl的缓冲液中反应，并通过凝胶过滤色谱和分子量测量检测到该复合物。结果，根据盐浓度，在不同的保留时间检测到两种蛋白质形成的复合峰。此外，在100 mM NaCl存在下，过氧化物降解活性被最大化，这表明该抗氧化剂系统具有改变复合形成模式的功能，并由于环境条件而调节其活性。（2）制备了酵母共表达的CVNTRC和CVPRX基因的制备和应激性测试，这些基因酵母单独或共表达CVNTRC和CVPRX基因，并进行了耐热性，耐热性和氧化应激耐药性的测试。结果，在仅表达CVNTRC和共表达这两个基因的酵母中，对总应激的耐药性增加。此外，在Menadione（氧化应激诱导剂）的存在下，两个基因的表达抑制了超氧化阴离子的积累。这一发现是第一个揭示涉及植物NTRC及其在体内功能的植物耐药性和耐热性的影响的结果。（3）使用PRI101-AN载体改性的基于植物的同时表达载体，从CAMV35S启动子到NOS终结剂的区域被PCR扩增，并使用限制性酶引入T-DNA区域，从而将两个不同的基因修改为可以单独同时表达的向量。（4）构建用于CVNTRC和CVPRX植物表达的载体，以及单独使用转化的农杆菌CVNTRC和CVPRX的生成，或在上一节（3）部分中纳入了载体，以创建植物表达构建体。该结构被引入农杆菌，并通过Colony Direct PCR证实了其引入。将来，我们将使用这种转化的农杆菌来转化拟南芥，以研究其参与和功能在获取该抗氧化剂系统的冻结抗性中。