膵幹細胞の可視化と選択的分離による系譜的解析

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【本年度(～平成22年3月31日)の研究実施状況】(1).現在、C57BL/6J-Tg(pdx-1-DsRed2)から分離した幹細胞クローンの培養系におけるタイムラプス解析を用いて、非対称分裂による自己複製が観察され、膵幹細胞であることが強く示唆された。非対称/対称分裂を恒常的に繰り返すクローンの観察に成功し、その大量定量データを取得可能な解析系の確立に成功した。現在、膵幹細胞をマウスから分離するための準備実験として、膵幹細胞と考えられる細胞集団において、Pdx-1+/CDX+/CDY+共陽性細胞が高い頻度で存在することを確認した。(2).フローサイトメトリーを用いて分離した膵幹/前駆細胞を、膵ストローマ細胞(stellate cells)や血管内皮細胞などと微小重力環境下に細胞集積体を形成させつつ共培養を行い、4種の膵内分泌細胞への成熟分化を観察する準備実験として、多光子顕微鏡を用いた観察系の確立中である。(3)重力分散型回転培養装置を用いた膵島様スフェロイド大量創出法の開発に向け、先行研究として開始しているマウス膵β細胞由来MIN6細胞を対象として、模擬微小重力環境を利用した革新的な新規三次元培養法により、微小な膵島様スフェロイドの再構成と大量創出法に関する基盤技術の開発を試みた。MIN6細胞の三次元培養により微小な膵島様スフェロイドが大量に創出可能であり、それらはグルコース応答性の高いインスリン分泌能を発揮できることが明らかになっている(論文未発表)。さらに、膵幹細胞の三次元培養により微小な膵島様スフェロイドの大量創出の準備実験として、マウス膵初代培養細胞の三次元培養を行い、MIN6と同様な膵島様スフェロイドの創出に成功した。このスフェロイドは、(1)細胞生存率が高く、(2)抗体免疫染色法を用いてinsulin/c-peptide/glucagon/pdx-1の発現を確認した。現在、ストレプトゾトシンを用いた糖尿病モデルマウスを作製し、マウス膵初代培養細胞から形成された膵島様スフェロイドの腎皮膜下への移植により、血糖降下作用等の治療効果の検討を行い、血糖の降下作用の確認中である。