バイオフィルム内脱窒細菌の生態解明 -系統・機能・生理生態のin situ検出-

阐明生物膜中反硝化细菌的生态学 - 系统发育、功能和生理生态的原位检测 -

• 批准号: 08J08181
• 负责人: 星野 辰彦
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (2009)The University of Tokyo (2008)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J08181/
• 关键词: 脱窒細菌; in situ検出; バイオフィルム; 機能遺伝子; 微生物生態; リン蓄積細菌; 活性汚泥; 環境微生物

平成20年度はin situ RCAのプロトコールを最適化し、P.stutzeri内部の脱窒に関わる遺伝子群(nirS,nosZ)を同時に検出する事に成功した。平成21年度はこのプロトコールを複合微生物生態系である環境サンプルに適用し、バクテリアの機能と系統をリンクすることを可能にする手法の開発をおこなった。サンプルとして、デンマーク・オールボーにある排水処理施設(生物学的リン除去プロセス)内の活性汚泥を用いた。活性汚泥から抽出したDNAからPCRにより脱窒を担う遺伝子の一つであるnirSを増幅し、クローンライブラリーを作成した。クローンライブラリー中で優占化するいくつかのクラスターを検出するためにin situ RCA用のプローブを設計し、活性汚泥中の脱窒細菌の検出を試みた結果、非常にクリアに脱窒細菌を検出できた。また、2種類のプローブを同時にアプライし、2種類の脱窒細菌の空間的分布を視覚化する事に成功した。さらに、検出された脱窒細菌の形態がリン蓄積細菌のものだと思われたため、16S rRNAを標的としたFISH法によりリン蓄積細菌を検出した後、in situ RCA法でnirS遺伝子を検出した。その結果、今回nirSクローンライブラリー中で優占化した配列がリン蓄積細菌由来であることがわかった。これは複合微生物系においてバクテリアの系統と機能をin situでリンクする事に成功した世界で初めての事例であり、機能と系統をリンクするという環境微生物生態学の10年来の課題を解決する成果である。今後、フローサイトメトリーやレーザーマイクロダイセクションなどにより、in situ RCAで機能に基づいて検出した細胞を分取、16S rRNA遺伝子の配列を決定することでさらに効率的に、機能と系統のリンクを行う事が可能であると思われる。

Pp.47-53 20 year は in situ RCA の プ ロ ト コ ー ル を optimization し, p. tutzeri internal の smothering off に masato わ る heritage 伝 subgroup (nirS, nosZ) を and に 検 out す る matter に success し た. Pp.47-53 21st annual は こ の プ ロ ト コ ー ル を compound microbial ecosystems で あ る environment サ ン プ ル に し, バ ク テ リ ア の function と system を リ ン ク す る こ と を may に す る gimmick の open 発 を お こ な っ た. サ ン プ ル と し て, デ ン マ ー ク · オ ー ル ボ ー に あ る drainage 処 manage facilities (biology リ ン remove プ ロ セ ス) の activated sludge を use い た. Activated sludge か ら spare し た DNA か ら PCR に よ り smothering off を bear traces of う 伝 son の a つ で あ る nirS を raised し, ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー を made し た. ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー で in optimization of chemical す る い く つ か の ク ラ ス タ ー を 検 out す る た め に in situ RCA with の プ ロ ー ブ を design し, の smothering off bacteria in activated sludge の 検 try out を み た results, very に ク リ ア に smothering off bacteria を 検 out で き た. ま た, 2 species の プ ロ ー ブ を simultaneously に ア プ ラ イ し, 2 species の smothering off bacteria の space distribution を apparent 覚 change す る matter に success し た. さ ら に, 検 さ れ た smothering off bacteria の form が リ ン accumulation bacteria の も の だ と think わ れ た た め, 16 s rRNA を mark と し た FISH method に よ り リ ン accumulation bacteria を 検 out し た after, the in situ method of RCA で nirS heritage 伝 son を 検 out し た. そ の results, now back to the nirS ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー で the best accounts for the し た match column が リ ン accumulation bacteria origin で あ る こ と が わ か っ た. こ れ は composite microbial system に お い て バ ク テ リ ア を と の system function in situ で リ ン ク す る matter に successful し た め the early で て の examples で あ り, functional と system を リ ン ク す る と い う の subject を の 10 years to solve environmental microbial ecology す る results で あ る. In the future, フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー や レ ー ザ ー マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン な ど に よ り, in situ RCA で function に づ い て 検 out し を た cells divide, 16 s rRNA heritage 伝 の match sequence を decided す る こ と で さ ら に に sharper rates, functional と system の リ ン ク を doeth う が may で あ る と think わ れ る.

项目成果

In situ Rolling Circle Amplification-Fluoresence in situ Hybridization(RCA-FISH)for the detetction of denitrification genes inside bacterial cells

原位滚环扩增-荧光原位杂交（RCA-FISH）用于检测细菌细胞内的反硝化基因

• 发表时间: 2009
• 作者: T.Hoshino;A.Schramm;星野辰彦;T.Hoshino;T.Hoshino;T.Hoshino
• 通讯作者: T.Hoshino

Detection of denitrifying genes inside a bacterial cell

细菌细胞内反硝化基因的检测

• 发表时间: 2009
• 作者: T.Hoshino;A.Schramm;星野辰彦;T.Hoshino
• 通讯作者: T.Hoshino

Detection of denitrification genes by in situ rollig circle amplification-fluorescence in situ hybridization to link metabolic potential with identity inside bacterial cells

通过原位滚环扩增-荧光原位杂交检测反硝化基因，将代谢潜力与细菌细胞内的身份联系起来

• 发表时间: 2010
• 期刊: Environmental Microbiology (In Press)
• 作者: T.Hoshino;A.Schramm
• 通讯作者: A.Schramm

How many target molecules are needed for FISH and CARD-FISH?

FISH 和 CARD-FISH 需要多少靶分子？

• 发表时间: 2008
• 作者: T.Hoshino;A.Schramm;星野辰彦;T.Hoshino;T.Hoshino;T.Hoshino;Tatsuhiko Hoshino
• 通讯作者: Tatsuhiko Hoshino

in situ Rolling Circle Amplification法による脱窒機能遺伝子の検出-細菌と機能のリンクへ向けて-

原位滚环扩增法检测反硝化功能基因 -走向细菌与功能的联系-

• 发表时间: 2010
• 作者: T.Hoshino;A.Schramm;星野辰彦
• 通讯作者: 星野辰彦